DTU DENMARK 09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD DTU - PowerPoint PPT Presentation

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD Perspec)ves ¡and ¡ USER ¡fusion ¡ Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ PHUSER ¡ applica)ons ¡ standard ¡

Outline 1. The ¡Redoxilator: ¡Gene3c ¡Design ¡ 2. Experimental ¡Results ¡ 3. Perspec3ves ¡and ¡Applica3ons ¡ 4. The ¡USER ¡Fusion ¡Assembly ¡Standard ¡ 5. PHUSER ¡soIware ¡ DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD Perspec)ves ¡and ¡ USER ¡fusion ¡ Introduc)on ¡ ¡ Introduc)on ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ PHUSER ¡ applica)ons ¡ standard ¡

Genetic design - approach Sensor ¡ AD ¡ Reporter ¡ • ¡Iden3fy ¡and ¡study ¡parts ¡ • ¡Assembly ¡of ¡parts ¡(in ¡silico) ¡ • ¡Model ¡in ¡silico ¡– ¡make ¡adjustments ¡ • ¡Chemically ¡synthesis ¡ DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD Perspec)ves ¡and ¡ USER ¡fusion ¡ Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Redoxilator ¡design ¡ PHUSER ¡ applica)ons ¡ standard ¡

Genetic design AD ¡ Sensor ¡ Reporter ¡ DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD Perspec)ves ¡and ¡ USER ¡fusion ¡ Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ PHUSER ¡ applica)ons ¡ standard ¡

Mechanism of the Redoxilator • ¡REX ¡ • ¡Bind ¡DNA ¡ • ¡Interact ¡with ¡NAD+ ¡and ¡NADH ¡ • ¡NADH ¡inhibits ¡DNA ¡binding ¡ability ¡ • ¡Ac3vate ¡transcrip3on ¡ DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD Perspec)ves ¡and ¡ USER ¡fusion ¡ Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Redoxilator ¡design ¡ PHUSER ¡ applica)ons ¡ standard ¡

Modelling – TF activation TF ¡ac)vity ¡  ¡ NAD+ ¡/NADH ¡ ¡  ¡ DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD Perspec)ves ¡and ¡ USER ¡fusion ¡ Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Redoxilator ¡design ¡ PHUSER ¡ applica)ons ¡ standard ¡

Modelling – GFP level GFP ¡level ¡  ¡ NAD+ ¡/NADH ¡ ¡  ¡ DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD Perspec)ves ¡and ¡ USER ¡fusion ¡ Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Redoxilator ¡design ¡ PHUSER ¡ applica)ons ¡ standard ¡

Modelling !" 8."! & ,-<=./010/ NAD+ Total NAD(H) = 5mM ! ! " # $ % & ' ( ) 23*0.456 "#!! mRNA "!!! *+,-./010/ )!! '!! %!! #!! ! ! " # $ % & ' ( ) 23*0.456 & 8."! # GFP "7& 9:;./010/ " !7& ! ! " # $ % & ' ( ) 23*0.456 DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD Perspec)ves ¡and ¡ USER ¡fusion ¡ Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Redoxilator ¡design ¡ PHUSER ¡ applica)ons ¡ standard ¡

Modelling !" )*"# *+,-.*/010/ NAD+ ¡ ¡ ! A &'( ! "# "! $# $! %# 289:;<83=23>:*?9<2>8*9<23132@ 2340*567 " TF ¡ac)vity ¡ B #'! # ! "# "! $# $! %# 2340*567 ! )*"# GFP ¡level ¡ ¡ $ ABC*/010/*5D7 C " # ! "# "! $# $! %# 2340*567 DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD Perspec)ves ¡and ¡ USER ¡fusion ¡ Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Redoxilator ¡design ¡ PHUSER ¡ applica)ons ¡ standard ¡

Results: Reporter gene DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD Perspec)ves ¡and ¡ USER ¡fusion ¡ Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Redoxilator ¡result ¡ PHUSER ¡ applica)ons ¡ standard ¡

Results: The Redoxilator Carbon ¡source ¡ Galactose ¡ Glucose ¡+ ¡ Galactose ¡ Glucose ¡ Ethanol ¡ DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD Perspec)ves ¡and ¡ USER ¡fusion ¡ Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Redoxilator ¡result ¡ PHUSER ¡ applica)ons ¡ standard ¡

Results: Redoxilator effect DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD Perspec)ves ¡and ¡ USER ¡fusion ¡ Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Redoxilator ¡result ¡ PHUSER ¡ applica)ons ¡ standard ¡

Results: Redoxilator effect DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD Perspec)ves ¡and ¡ USER ¡fusion ¡ Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Redoxilator ¡result ¡ PHUSER ¡ applica)ons ¡ standard ¡

Future perspectives Kanamycin ¡ ¡ resistance ¡gene ¡ PacI ¡restric3on ¡site ¡ SwaI ¡USER ¡site ¡ 2 ¡mikron ¡ Destabilized ¡GFP ¡ (yeast ¡origin ¡of ¡ ¡ Redoxilator ¡ replica3on) ¡ construct ¡ PacI ¡restric3on ¡site ¡ 8851bp ¡ SwaI ¡USERsite ¡ NotI ¡restric3on ¡site ¡ AsiSI ¡USERsite ¡ URA3 ¡ Redoxilator ¡ (yeast ¡marker) ¡ NotI ¡USER ¡site ¡ AsiSI ¡restric3on ¡site ¡ DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD Perspec)ves ¡and ¡ Perspec)ves ¡and ¡ USER ¡fusion ¡ Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ PHUSER ¡ applica)ons ¡ applica)ons ¡ standard ¡

Future perspectives • Fusion ¡to ¡His-­‑tag ¡to ¡characterize ¡binding ¡affinity ¡to ¡ROB ¡ • Mutagenesis ¡on ¡NAD + ¡binding ¡site ¡and ¡characterize ¡binding ¡ affinity ¡ ¡change ¡ DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD Perspec)ves ¡and ¡ Perspec)ves ¡and ¡ USER ¡fusion ¡ Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ PHUSER ¡ applica)ons ¡ applica)ons ¡ standard ¡

Applications • In ¡vivo ¡redox ¡sensor ¡ • Test ¡redox ¡level ¡in ¡different ¡yeast ¡strains ¡ • Applica)ons ¡in ¡cancer ¡research ¡ • Gene ¡therapy ¡with ¡DNA ¡coding ¡for ¡the ¡Redoxilator ¡controlling ¡ the ¡transcrip)on ¡of ¡a ¡cancer ¡drug ¡ • Improved ¡product ¡forma)on ¡in ¡chemostat ¡ • High ¡produc)vity ¡can ¡be ¡maintained ¡for ¡long ¡periods ¡of ¡)me ¡ • Over ¡)me ¡chemostat ¡produc)on ¡decreases ¡and ¡the ¡en)re ¡ fermenta)on ¡needs ¡to ¡be ¡restarted. ¡ DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD Perspec)ves ¡and ¡ Perspec)ves ¡and ¡ USER ¡fusion ¡ Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ PHUSER ¡ applica)ons ¡ applica)ons ¡ standard ¡

USER fusion – The assembly standard DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD USER ¡fusion ¡ Perspec)ves ¡and ¡ USER ¡fusion ¡ Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ PHUSER ¡ applica)ons ¡ standard ¡ standard ¡

USER cloning DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD USER ¡fusion ¡ Perspec)ves ¡and ¡ USER ¡fusion ¡ Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ PHUSER ¡ applica)ons ¡ standard ¡ standard ¡

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The USER cassette DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD USER ¡fusion ¡ Perspec)ves ¡and ¡ USER ¡fusion ¡ Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ PHUSER ¡ applica)ons ¡ standard ¡ standard ¡

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