Studying Anaerobic Fungi For Use In Biofuel Applica9ons - PowerPoint PPT Presentation

Studying ¡Anaerobic ¡Fungi ¡For ¡Use ¡In ¡ Biofuel ¡Applica9ons ¡ Chris ¡Eachus, ¡Chemical ¡ Engineering ¡Undergraduate ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ Mentor: ¡Charles ¡Haitjema, ¡ Ph.D. ¡ P.I.: ¡Prof. ¡Michelle ¡O’Malley ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ Image ¡courtesy ¡of: ¡eandt.theiet.org ¡

Anaerobic ¡Fungi ¡Naturally ¡Break ¡Down ¡ Cellulose ¡in ¡to ¡Sugars ¡ • Break ¡down ¡followed ¡by ¡fermenta9on ¡leads ¡to ¡valuable ¡ products ¡ BoPleneck ¡ ¡ Breakdown ¡ Fermenta9on ¡ Lignin ¡ ¡ Glucose ¡(sugar) ¡ Cellulose ¡ ¡ Hemicellulose ¡ Esters ¡ ¡ Lignofuel.wordpress.com ¡ 4vector.com ¡ Why ¡do ¡we ¡care? ¡ • Cellulosic ¡biofuels ¡are ¡a ¡promising ¡renewable ¡energy ¡source ¡ • Will ¡help ¡strengthen ¡the ¡economy, ¡na9onal ¡security, ¡and ¡ decrease ¡environmental ¡impacts ¡of ¡energy ¡use ¡ ¡

Compe9ng ¡Models ¡for ¡Enzyme ¡ Complexes ¡ Model ¡A: ¡Enzymes ¡are ¡ Model ¡B: ¡Enzymes ¡run ¡ anchored ¡ freely ¡ Enzyme ¡ Courtesy ¡of: ¡Charles ¡Haitjema ¡ Known: ¡ ¡ -­‑ ¡ Enzymes ¡assemble ¡in ¡to ¡large ¡complexes ¡ -­‑ ¡ Iden9ty ¡of ¡Dockerin ¡domains ¡ ¡ Unknown: ¡ ¡ -­‑ Cohesin ¡binding ¡partners ¡for ¡dockerin ¡domains ¡ -­‑ Which ¡model ¡most ¡closely ¡resembles ¡how ¡the ¡enzymes ¡behave ¡

Research ¡Goals ¡ Short ¡Term ¡ Iden9fy ¡Cohesin ¡domains ¡ ¡ Iden9fy ¡which ¡model ¡most ¡closely ¡matches ¡how ¡the ¡enzymes ¡ actually ¡behave ¡ Intermediate ¡ Gain ¡a ¡complete ¡understanding ¡of ¡the ¡enzymes ¡that ¡mediate ¡the ¡ breakdown ¡of ¡biomass ¡ Long ¡Term ¡ www.dreams9me.com ¡

Crosslinking ¡Experiments ¡Are ¡Used ¡to ¡ Observe ¡How ¡Proteins ¡Interact ¡ Crosslinking ¡reagent ¡ PROTEIN ¡1 ¡ PROTEIN ¡1 ¡ PROTEIN ¡2 ¡ PROTEIN ¡1 ¡ PROTEIN ¡2 ¡ PROTEIN ¡1 ¡ Publish.uwo.ca ¡ Before ¡crosslinking ¡can ¡be ¡executed, ¡pure ¡protein ¡ is ¡needed…… ¡

Protein ¡Purifica9on ¡Procedure ¡ DAY ¡1: ¡ Start ¡ DAY ¡3: ¡ Centrifuge, ¡ DAY ¡2: ¡ Upscale, ¡ overnight ¡culture ¡in ¡ Collect/Break ¡open ¡ Incubate ¡overnight ¡ a ¡test ¡tube ¡ Cells ¡ Run ¡supernatant ¡ Check ¡for ¡Purity ¡ ¡Collect ¡soluble ¡ liquid ¡through ¡a ¡ (Gel ¡ frac9on ¡ Nickel ¡Column ¡to ¡ Electrophoresis) ¡ ¡ (Supernatant) ¡ filter ¡out ¡impuri9es ¡

Protein ¡Purifica9on ¡Summary ¡ 2) ¡Break ¡Open ¡Cells ¡ 1) ¡Start ¡Culture ¡ Ni 2+ ¡ions ¡(binding ¡ Desired ¡Protein ¡ material) ¡ 3) ¡Filter ¡out ¡unwanted ¡proteins ¡ Non-­‑binding ¡ proteins ¡

Results ¡of ¡Protein ¡Purifica9on ¡ Acrylamide ¡Gel ¡ ¡ Western ¡Blot ¡ 37 ¡kDa ¡ Successful ¡ ¡purifica9on ¡of ¡ 13208 ¡Dockerin ¡protein ¡ 25 ¡kDa ¡ (Finally!!). ¡Ready ¡to ¡use ¡in ¡ crosslinking ¡experiments ¡to ¡ iden9fy ¡binding ¡partners. ¡ ¡ Proteins ¡of ¡interest ¡

Crosslinking ¡Experiments ¡Reveal ¡A ¡ Binding ¡Partner ¡With ¡Mass ¡of ¡~75 ¡kDa ¡ Crosslinked ¡Protein ¡ 75 ¡kDa ¡ 50 ¡kDa ¡ Further ¡analysis ¡is ¡needed ¡to ¡ 37 ¡kDa ¡ determine ¡molecular ¡structure ¡of ¡ the ¡binding ¡partner ¡ 25 ¡kDa ¡ Dockerin ¡Protein ¡

Summary ¡ Cohesin ¡binding ¡partners ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡for ¡Dockerin ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ domains ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡have ¡been ¡iden9fied ¡by ¡use ¡of ¡a ¡ chemical ¡crosslinker ¡ Future ¡Work ¡ Fully ¡characterize ¡Anaerobic ¡ gut ¡fungi ¡enzyme ¡complex ¡ Further ¡analyze ¡binding ¡partners ¡fungal ¡ ? ¡ proteins ¡using ¡mass ¡spectrometry ¡ Use ¡this ¡understanding ¡to ¡create ¡ syntheRc ¡enzymes ¡to ¡breakdown ¡ biomass ¡