¡ 2 ¡-‑ ¡Rela3onship ¡between ¡axonal ¡caliber, ¡ arbor ¡length ¡and ¡motor ¡unit ¡size ¡ ¡ • Axonal ¡caliber ¡is ¡propor3onal ¡to ¡axoplasmic ¡ ¡ transport, ¡therefore ¡it ¡may ¡scale ¡with ¡ downstream ¡metabolic ¡expenditure. ¡ ¡ • The ¡energy ¡expenditure ¡= ¡res3ng ¡and ¡ac3on ¡ poten3als ¡instead ¡of ¡synap3c ¡transmission ¡ – propor3onal ¡to ¡the ¡surface ¡area ¡of ¡the ¡axonal ¡ membrane. ¡ ¡ • As ¡long ¡as ¡axonal ¡caliber ¡remains ¡rela3vely ¡ constant, ¡the ¡surface ¡area ¡is ¡propor3onal ¡to ¡ arbour ¡length ¡– ¡may ¡explain ¡linear ¡rela3onship ¡ between ¡axonal ¡caliber ¡and ¡arbor ¡length. ¡ ¡
3. ¡Axon ¡Variability ¡ ¡ A ¡-‑ ¡Unique ¡branching ¡structures ¡ B ¡-‑ ¡Nerve ¡fascicula3on ¡paZerns ¡ C ¡-‑ ¡Variability ¡between ¡L ¡and ¡R ¡connectomes ¡
¡ 3A ¡-‑ ¡Unique ¡Axonal ¡Branching ¡ Structure ¡of ¡Motor ¡Neurons ¡ ¡ • Primary ¡subtrees ¡of ¡ individual ¡axons ¡were ¡ not ¡uniformly ¡ distributed ¡– ¡appeared ¡ to ¡invade ¡non ¡ overlapping ¡territories ¡ • Primary ¡subtrees ¡ NMJs ¡innervated ¡by ¡one ¡subtree ¡(orange) ¡are ¡marked ¡ by ¡red ¡dots; ¡NMJs ¡innervated ¡by ¡the ¡other ¡subtree ¡ belonging ¡to ¡different ¡ (cyan) ¡are ¡marked ¡by ¡green ¡dots. ¡Lines ¡connec3ng ¡dots ¡ are ¡the ¡minimal-‑spanning ¡tree ¡(MST) ¡constructed ¡from ¡ axons ¡tend ¡to ¡have ¡ the ¡coordinates ¡of ¡NMJs. ¡ ¡ The ¡MST ¡is ¡par33oned ¡into ¡two ¡disjoint ¡subtrees, ¡each ¡ overlapping ¡territories ¡ corresponding ¡to ¡one ¡subtree ¡of ¡the ¡original ¡axonal ¡ arbor. ¡
3A ¡-‑ ¡Unique ¡ Axonal ¡Branching ¡ Structure ¡of ¡Motor ¡Neurons ¡ • This ¡arrangement ¡suggests ¡a ¡developmental ¡ mechanism ¡that ¡prevents ¡mul3ple ¡branches ¡of ¡ the ¡same ¡axon ¡from ¡projec3ng ¡to ¡the ¡same ¡ region ¡(self ¡avoidance?) ¡ ¡ – mul3ple ¡axons ¡innervate ¡the ¡same ¡muscle ¡fiber ¡at ¡ early ¡developmental ¡stages, ¡whereas ¡rarely ¡do ¡ two ¡branches ¡of ¡the ¡same ¡axon ¡innervate ¡a ¡single ¡ muscle ¡fibre. ¡ ¡
3B ¡-‑ ¡Nerve ¡Fascicula3on ¡PaZerns ¡ • Fascicula3on: ¡ the ¡tendency ¡of ¡developing ¡ neurites ¡to ¡grow ¡along ¡exis2ng ¡neurons ¡and ¡ hence ¡form ¡bundles/fascicles ¡ • Rela3onship ¡between ¡branching ¡structures ¡of ¡ individual ¡axons ¡and ¡nerve ¡fascicles ¡was ¡ surprisingly ¡complicated. ¡ • Axons ¡branching ¡behaviour ¡was ¡not ¡strictly ¡ coupled ¡to ¡the ¡fascicula3on ¡paZern ¡of ¡the ¡ nerve. ¡ ¡
3B ¡-‑ ¡Nerve ¡Fascicula3on ¡PaZerns ¡ At ¡some ¡nerve ¡branching ¡points ¡ Some ¡axons ¡branched ¡inside ¡a ¡ no ¡axons ¡branched, ¡different ¡ nerve ¡segment ¡and ¡the ¡resultant ¡ axons ¡simply ¡followed ¡one ¡of ¡the ¡ branches ¡travelled ¡in ¡parallel ¡ paths ¡ along ¡the ¡same ¡segment ¡
3B ¡-‑ ¡Nerve ¡Fascicula3on ¡PaZerns ¡ • Although ¡most ¡fasciculated ¡ nerve ¡segments ¡travel ¡in ¡a ¡ proximal-‑distal ¡direc3on, ¡ some ¡axonal ¡branches ¡ contained ¡in ¡them ¡did ¡not ¡not ¡ follow ¡the ¡same ¡direc3on. ¡ ¡ • Overall ¡89.4% ¡of ¡the ¡axons ¡ deviated ¡in ¡some ¡way ¡from ¡ being ¡a ¡proper ¡subgraph ¡of ¡ the ¡nerve ¡fascicula/on ¡ paQern. ¡ ¡ • Seems ¡unlikely ¡that ¡nerve ¡ fascicula/on ¡paQerns ¡in ¡a ¡ muscle ¡are ¡gene/cally ¡ predetermined. ¡ ¡ Axonal ¡branches ¡traveling ¡in ¡opposite ¡ direc3ons ¡in ¡the ¡same ¡nerve ¡fascicle. ¡ ¡
3C ¡-‑ ¡Variability ¡between ¡L ¡and ¡R ¡ connectomes ¡ • Compared ¡differences ¡between ¡L ¡and ¡R ¡copies ¡of ¡ the ¡interscutularis ¡muscle. ¡ ¡ – Number ¡of ¡muscle ¡fibers ¡on ¡L ¡and ¡R ¡side ¡= ¡not ¡ significantly ¡different ¡ – Distribu3on ¡of ¡muscle ¡fiber ¡types ¡= ¡not ¡significantly ¡ different. ¡ ¡ – Number ¡of ¡innerva3ng ¡motor ¡neurons ¡= ¡not ¡ significantly ¡different ¡ – No ¡evidence ¡for ¡common ¡branching ¡paQerns ¡ – Wide ¡range ¡of ¡different ¡topologies ¡between ¡axons ¡of ¡ the ¡same ¡rank ¡
3C ¡-‑ ¡Variability ¡between ¡L ¡and ¡R ¡ connectomes ¡ Largest ¡motor ¡units ¡ exhibited ¡different ¡ topological ¡structures ¡ Ten ¡motor ¡units ¡with ¡ iden3cal ¡motor ¡unit ¡size ¡for ¡ 6 ¡muscles ¡all ¡had ¡different ¡ topologies ¡
3C ¡-‑ ¡Variability ¡between ¡L ¡and ¡R ¡ connectomes ¡ ¡Used ¡TED ¡(tree-‑edi3ng ¡distance) ¡to ¡quan3fy ¡ ¡topological ¡differences ¡between ¡axons. ¡ TED ¡differences ¡not ¡significant ¡ between ¡intra-‑animal ¡L ¡and ¡R ¡ pairs, ¡inter-‑animal ¡ipsi-‑lateral ¡and ¡ inter-‑animal ¡L ¡and ¡R ¡pairs. ¡ ¡
3 ¡-‑ ¡Axon ¡Variability ¡ • Intra-‑animal ¡variance ¡surprising ¡as ¡each ¡pair ¡of ¡ neurons ¡has ¡an ¡iden3cal ¡gene3c ¡background. ¡ • Suggests ¡branching ¡paZerns ¡of ¡these ¡neurons ¡is ¡not ¡ predetermined, ¡contrasts ¡strongly ¡with ¡the ¡situa3on ¡in ¡ invertebrates. ¡ ¡ – C.elegans ¡connectome ¡revealed ¡remarkable ¡stereotypy ¡in ¡ the ¡structure ¡of ¡the ¡neural ¡circuit. ¡ ¡ • In ¡mammals ¡the ¡variability ¡in ¡pre-‑terminal ¡branching ¡ and ¡NMJs ¡structure ¡suggests ¡that ¡axonal ¡branching ¡in ¡ the ¡mammalian ¡system ¡is ¡fundamentally ¡different ¡from ¡ that ¡found ¡in ¡invertebrates. ¡ ¡
¡ 4 ¡-‑ ¡Subop3mal ¡Wiring ¡Length ¡ ¡ • Axonal ¡trajectories ¡did ¡not ¡adhere ¡to ¡the ¡ principle ¡of ¡minimiza3on ¡of ¡total ¡wiring ¡length ¡ (which ¡is ¡supported ¡by ¡the ¡full ¡reconstruc3on ¡ of ¡the ¡C.elegans ¡NS) ¡ • Inspec3on ¡of ¡the ¡connectome ¡showed ¡that ¡ almost ¡every ¡axons ¡total ¡length ¡could ¡be ¡ shortened ¡by ¡following ¡different ¡nerve ¡ fascicles ¡or ¡altering ¡the ¡loca3on ¡of ¡branching ¡ points. ¡ ¡
4 ¡-‑ ¡Subop3mal ¡Wiring ¡Length ¡ Wiring ¡of ¡motor ¡axons ¡was ¡ superimposed ¡on ¡the ¡nerve ¡ fascicles ¡of ¡the ¡en3re ¡ muscle. ¡Axon ¡took ¡a ¡long ¡ detour ¡(yellow ¡arrows) ¡even ¡ though ¡a ¡much ¡shorter ¡path ¡ existed ¡(black ¡arrow). ¡In ¡ addi3on, ¡it ¡did ¡not ¡branch ¡ directly ¡to ¡innervate ¡the ¡ NMJ ¡to ¡the ¡leh, ¡but ¡only ¡did ¡ so ¡aher ¡looping ¡back ¡(white ¡ arrows). ¡ ¡
4 ¡-‑ ¡Subop3mal ¡Wiring ¡Length ¡ • C.elegans ¡neural ¡wiring ¡approximates ¡the ¡op3mal ¡ solu3on ¡fairly ¡well ¡ • Subop3mality ¡in ¡wiring ¡length ¡does ¡not ¡imply ¡that ¡the ¡ op3miza3on ¡principle ¡is ¡inapplicable, ¡rather ¡suggests ¡ that ¡factors ¡other ¡than ¡wiring ¡length ¡also ¡play ¡a ¡ significant ¡role ¡ • Invertebrate ¡system ¡= ¡gene3c ¡control ¡ • The ¡mammalian ¡system ¡may ¡rely ¡more ¡strongly ¡on ¡ ac3vity ¡dependent ¡reorganisa3ons ¡for ¡each ¡individual ¡ neural ¡circuit ¡to ¡seZle ¡on ¡a ¡par3cular ¡wiring ¡scheme ¡– ¡ does ¡not ¡guarantee ¡op3mal ¡wiring ¡but ¡ only ¡arrives ¡at ¡ a ¡solu/on ¡that ¡is ¡func/onally ¡acceptable. ¡ ¡
Conclusions ¡ • 4 ¡organisa3onal ¡principles ¡of ¡neuromuscular ¡ circuits ¡ ¡ 1. Evidence ¡for ¡the ¡size ¡principle ¡ 2. Correla3ons ¡between ¡axonal ¡caliber, ¡arbor ¡ length ¡and ¡motor ¡unit ¡size ¡ 3. Unique ¡Axonal ¡Branching ¡Structure ¡– ¡even ¡ between ¡L ¡and ¡R ¡muscles ¡from ¡same ¡animal ¡ 4. Subop3mal ¡Wiring ¡Length ¡
Synap3c ¡Compe33on ¡ This ¡strategy ¡allows ¡a ¡ different ¡instan3a3on ¡to ¡ arise ¡in ¡each ¡case ¡and ¡ explains ¡the ¡intra-‑ ¡and ¡ inter-‑animal ¡differences ¡ found ¡in ¡this ¡study ¡
Difficul3es ¡ • Tightly ¡fasciculate ¡branches ¡ – manual ¡interven3on-‑ ¡reduced ¡the ¡speed ¡of ¡ reconstruc3on ¡ – These ¡technical ¡difficul3es ¡would ¡be ¡even ¡greater ¡if ¡ the ¡same ¡imaging ¡techniques ¡were ¡to ¡be ¡used ¡for ¡the ¡ CNS ¡as ¡the ¡length ¡scale ¡of ¡neural ¡structures ¡is ¡much ¡ smaller ¡and ¡the ¡packing ¡of ¡neurophil ¡is ¡much ¡denser ¡ – Future ¡innerva3ons ¡required ¡to ¡facilitate ¡this ¡fully ¡ automated ¡reconstruc3on, ¡e.g ¡ • Different ¡colours ¡– ¡spectrally ¡separate ¡different ¡neurons ¡ • Super-‑resolu3on ¡imaging ¡techniques ¡
Strengths ¡and ¡Weaknesses ¡ -‑ Only ¡used ¡interscutularis ¡muscle ¡– ¡has ¡certain ¡ features ¡that ¡aren’t ¡present ¡in ¡the ¡rest ¡of ¡the ¡NS ¡ and ¡therefore ¡findings ¡cannot ¡be ¡generalised ¡to ¡the ¡ whole ¡of ¡ ¡the ¡mammalian ¡connectome. ¡ ¡ -‑ Very ¡small ¡sample ¡size ¡–only ¡used ¡4 ¡mice ¡ + ¡ ¡ ¡ ¡Tested ¡reconstruc3on ¡accuracy ¡ + ¡ ¡ ¡ ¡Connectome ¡very ¡well ¡characterised ¡ + ¡ ¡ ¡ ¡Overall ¡well ¡wriZen ¡paper ¡
Clinical ¡Relevance ¡ • NIH ¡(na3onal ¡ins3tute ¡of ¡health) ¡Human ¡Connectome ¡ Project ¡ – Researchers ¡hope ¡to ¡understand ¡the ¡normal ¡variability ¡of ¡ human ¡connectomes ¡and ¡how ¡they ¡change ¡and ¡rewrite ¡ themselves ¡as ¡humans ¡learn, ¡mature, ¡and ¡age. ¡ ¡ – will ¡set ¡the ¡stage ¡for ¡future ¡studies ¡of ¡how ¡connectomes ¡ become ¡dysfunc3onal ¡in ¡many ¡neurological ¡and ¡ psychiatric ¡disorders. ¡ – Likely ¡to ¡be ¡very ¡3me ¡consuming. ¡Mapping ¡the ¡C.elegans ¡ connectome ¡took ¡over ¡a ¡decade ¡and ¡that ¡only ¡consists ¡of ¡ 300 ¡neurons ¡joined ¡by ¡7000 ¡connec3ons ¡– ¡the ¡human ¡ brain ¡consists ¡of ¡86 ¡billion ¡neurons ¡and ¡100 ¡trillion ¡ synapses ¡ ¡ ¡
The ¡Human ¡Connectome ¡Project ¡ White ¡maZer ¡fibres ¡– ¡cor3cospinal ¡ White ¡MaZer ¡fibres ¡– ¡parietal ¡areas ¡ tract ¡and ¡temporal ¡lobe ¡ White ¡maZer ¡fibres-‑arcuate ¡ fasciculus ¡and ¡pons ¡leh ¡
Is ¡it ¡really ¡worth ¡it? ¡ • Some ¡scien3sts ¡believe ¡that ¡the ¡C.elegans ¡connectome ¡has ¡not ¡ provided ¡many ¡useful ¡insights ¡into ¡the ¡worms ¡behaviour ¡ • They ¡argue ¡that ¡mapping ¡the ¡human ¡connectome ¡would ¡be ¡far ¡too ¡ 3me ¡consuming ¡and ¡we ¡wouldn’t ¡know ¡how ¡to ¡interpret ¡it ¡ • " When ¡you ¡move ¡onto ¡behaviours ¡that ¡are ¡more ¡complex ¡than ¡a ¡ quick ¡reflex, ¡you're ¡dealing ¡with ¡especially ¡complicated ¡pathways ¡ that ¡are ¡not ¡immediately ¡interpretable ¡because ¡they ¡are ¡not ¡simple ¡ circuits—they ¡are ¡networks ," ¡ ¡ – ScoZ ¡Emmons, ¡Albert ¡Einstein ¡College ¡of ¡Medicine ¡ • However, ¡without ¡such ¡maps ¡scien3sts ¡cannot ¡thoroughly ¡ understand ¡how ¡the ¡brain ¡processes ¡informa3on ¡at ¡the ¡level ¡of ¡the ¡ circuit. ¡
Big ¡Burning ¡Ques3on ¡ How ¡does ¡synap,c ¡compe,,on ¡lead ¡to ¡the ¡wiring ¡ diagram ¡and ¡differences ¡in ¡the ¡diagram ¡within ¡and ¡ between ¡animals? ¡What ¡is ¡the ¡poten,al ¡medical ¡ significance ¡of ¡this? ¡ ¡ • Synap3c ¡compe33on ¡leads ¡to ¡differences ¡in ¡the ¡ wiring ¡diagram ¡as ¡it ¡is ¡ac3vity ¡dependent ¡ • Mapping ¡the ¡human ¡connectome ¡– ¡may ¡lead ¡to ¡ further ¡understanding ¡of ¡how ¡connectomes ¡ become ¡dysfunc3onal ¡and ¡therefore ¡uncover ¡the ¡ exact ¡mechanisms/lead ¡to ¡new ¡treatments ¡for ¡ neurological ¡and ¡psychiatric ¡disorders ¡ ¡ ¡ ¡
Identity, ¡Developmental ¡restriction ¡ and ¡reactivity ¡of ¡extralaminar ¡cells ¡ capping ¡mammalian ¡ neuromuscular ¡junctions. ¡ ¡ KRANOCYTES ¡ Felipe ¡A. ¡Court, ¡Thomas ¡H. ¡Gillingwater, ¡Shona ¡Melrose, ¡Diane ¡L. ¡Sherman, ¡Kay ¡N. ¡Greenshields, ¡A. ¡Jennifer ¡Morton, ¡John ¡B. ¡ Harris, ¡Hugh ¡J. ¡Willison ¡and ¡Richard ¡R. ¡Ribchester. ¡ (PDF) ¡
Introduction ¡ NMJ: ¡Synapse ¡of ¡axon ¡terminal ¡of ¡motor ¡neuron ¡and ¡motor ¡endplate ¡of ¡the ¡muscle. ¡ Signals ¡are ¡transmitted ¡across ¡the ¡synapse ¡to ¡cause ¡contraction ¡of ¡the ¡muscle. ¡ ¡ � 4 ¡Types ¡of ¡cell ¡involved ¡in ¡NMJ ¡ ¡ � Skeletal ¡Muscle ¡Fibres ¡ ¡ � Motor ¡Neuron ¡terminals ¡ ¡ � Perisynaptic ¡Terminal ¡ Schwann ¡cells ¡ ¡ � ‘KRANOCYTES’ ¡– ¡NMJ ¡ capping ¡cells . ¡ ¡ ¡
Aims ¡of ¡study ¡ � To ¡propose ¡a ¡fourth ¡cell ¡type: ¡The ¡NMJ ¡capping ¡cell ¡– ¡ ‘Kranocyte’. ¡ ¡ � Determine ¡function ¡of ¡Kranocytes ¡and ¡mechanism ¡of ¡ action. ¡ ¡ ¡ � Understanding ¡organisation ¡of ¡cells ¡in ¡NMJ ¡may ¡have ¡ implications ¡for ¡cellular ¡and ¡molecular ¡targets ¡for ¡ neuromuscular ¡diseases ¡(ALS ¡/ ¡SMA ¡) ¡ ¡ ¡ ¡ -‑ Distinct ¡cell ¡type ¡ ¡and ¡Integral ¡cellular ¡component ¡… ¡
Diagram ¡should ¡look ¡more ¡like… ¡
Methods ¡ ¡ � 2166 ¡antibody ¡produced ¡from ¡peptide ¡corresponding ¡to ¡ Tspan-‑2 ¡protein. ¡ ¡Western ¡blotting ¡was ¡used ¡identify ¡the ¡ associated ¡antigen ¡– ¡47kDa. ¡ ¡Similar ¡molecular ¡weight ¡to ¡ tubulin ¡however ¡antibody ¡did ¡not ¡recognise ¡tubulin ¡on ¡ western ¡blots. ¡Remains ¡unidentified. ¡ ¡ � Stained ¡cytoskeleton. ¡ ¡A ¡new ¡subpopulation ¡of ¡cells. ¡ � ¡Transgenic ¡mice ¡used ¡in ¡exp. ¡: ¡ ¡ � C57B1/6 ¡ � S100-‑eGFP ¡transgenic ¡ ¡ � R6/2 ¡transgenic ¡ � Tenascin-‑C-‑null ¡mutant. ¡ ¡
A-‑ ¡Staining ¡with ¡2166 ¡antibody ¡shows ¡NMJ ¡capping ¡cells ¡at ¡NMJs ¡ B-‑ ¡Capping ¡cells ¡– ¡green. ¡ ¡Motor ¡endplate-‑ ¡Red ¡(TRITC-‑α-‑BTX) ¡ C ¡– ¡capping ¡cells-‑ ¡green. ¡Motor ¡endplate ¡– ¡blue. ¡Axon ¡– ¡Red ¡ ¡ F ¡– ¡Each ¡NMJ ¡has ¡at ¡least ¡1 ¡capping ¡cell. ¡No ¡more ¡than ¡3. ¡ ¡
Located ¡3 ¡µm ¡away ¡from ¡ muscle ¡fibre ¡surface, ¡ OUTSIDE ¡BASAL ¡LAMINA. ¡ ¡ Supplementary ¡Figure ¡S2 ¡ ¡ Laminin ¡= ¡red. ¡ Alexa ¡Fluor ¡647-‑α-‑BTX ¡(binds ¡nAChR ¡of ¡post ¡ synaptic ¡membrane) ¡ ¡= ¡blue ¡ ¡ ¡ ¡
Distinct ¡cell ¡type ¡ ¡ � Arrow ¡shows ¡junctional ¡folds ¡in ¡basal ¡lamina ¡– ¡kranocytes ¡sit ¡outside ¡this. ¡ ¡ ¡ Double ¡immunostaining ¡with ¡ 2166 ¡and ¡ • GFAP ¡or ¡Nestin ¡antibodies ¡showed ¡no ¡ colocalisation ¡ ¡ NOT ¡TERMINAL ¡SCHWANN ¡CELLS ¡ ¡ • S100-‑eGFP ¡mice-‑ ¡ ¡ myelinating ¡and ¡terminal ¡ • schwann ¡cells ¡endogenously ¡flourescent. ¡ ¡ ¡ Different ¡patterns ¡of ¡flourescence. ¡2166 ¡ cells ¡extend ¡boundaries ¡of ¡schwann ¡cell ¡ membrane. ¡ ¡ 2166 ¡cells ¡ M-‑cadherin, ¡N-‑CAM ¡or ¡desmin ¡ • negative . ¡ ¡Not ¡muscle ¡satellite ¡cells. ¡ F4/80 ¡negative ¡ – ¡not ¡macrophage ¡ ¡ • Perisynaptic ¡fibroblast? ¡ •
Perisynaptic ¡fibroblasts ¡ ¡ � Robertson, ¡J.D. ¡(1956) ¡– ¡ Endoneurial ¡cells . ¡“Near ¡ myoneural ¡junctions ¡the ¡endoneurial ¡sheath ¡consists ¡ of ¡a ¡thin ¡sheet ¡of ¡cells ¡with ¡scattered ¡collagen ¡fibrils ¡ around ¡it ¡forming ¡a ¡complete ¡tube, ¡enveloping ¡small ¡ nerve ¡fibres.” ¡ (PDF) ¡ � Weiss ¡ et ¡al. ¡ (1991) ¡– ¡ Perisynaptic ¡fibroblasts . ¡ “After ¡ skeletal ¡muscle ¡is ¡denervated, ¡fibroblasts ¡near ¡ neuromuscular ¡junctions ¡proliferate ¡more ¡than ¡ fibroblasts ¡distant ¡from ¡synaptic ¡sites, ¡and ¡they ¡ accumulate ¡adhesive ¡molecules ¡such ¡as ¡tenascin.This ¡ response ¡could ¡reflect ¡signals ¡that ¡arise ¡ perisynaptically ¡after ¡denervation, ¡preexisting ¡ differences ¡between ¡perisynaptic ¡and ¡extrasynaptic ¡ Robertson ¡(1956) ¡ ¡ fibroblasts, ¡or ¡both.” ¡ (PDF) ¡ ¡ � Not ¡fibroblasts ¡– ¡2166 ¡+ve ¡cells ¡do ¡not ¡correspond ¡to ¡ Thy-‑1-‑positive ¡perisynaptic ¡fibroblasts. ¡ ¡
Figure ¡4 ¡from ¡Weiss ¡(1991). ¡
Immunostaining ¡to ¡reveal ¡distinct ¡cellular ¡ profile ¡ � 2166 ¡– ¡Cytoskeleton ¡ ¡ � HM-‑24 ¡– ¡Strong ¡resemblence ¡to ¡neuregulin ¡staining ¡attributed ¡to ¡terminal ¡schwann ¡cells ¡ (Trinidad ¡et ¡al. ¡2000). ¡Not ¡seen ¡in ¡S100-‑eGFP ¡schwann ¡cells. ¡ ¡ HM-‑24= ¡2166? ¡** ¡ � rPH ¡– ¡No ¡overlap ¡in ¡staining ¡but ¡strong ¡association. ¡ ¡Stains ¡different ¡cytoskeletal ¡ component…Endoplasmic ¡Reticulum? ¡ ¡ � CD34 ¡– ¡ ¡Cell ¡surface ¡marker, ¡therefore ¡stains ¡plasma ¡membrane. ¡Haematopoietic ¡stem ¡cell ¡ marker. ¡Pluripotency ¡capacity? ¡Regeneration? ¡ ¡ � Cholera ¡toxin ¡B ¡(CTB) ¡ – ¡Plasma ¡membranes ¡of ¡NMJ ¡capping ¡cells ¡(absent ¡from ¡Schwann ¡ cells). ¡ ¡As ¡it ¡is ¡selective ¡to ¡kranocytes ¡could ¡be ¡important ¡in ¡the ¡discovery ¡of ¡a ¡more ¡ selective ¡way ¡to ¡ablate ¡kranocytes ¡for ¡the ¡formation ¡of ¡a ¡knockout ¡mouse ¡ – ¡long ¡term ¡ effects ¡could ¡be ¡studied. ¡ ¡ Fig. ¡2B ¡
Post ¡natal ¡restriction ¡ � 2166 ¡+ve ¡cells ¡normally ¡restricted ¡to ¡NMJs. ¡ ¡ Proliferate ¡through ¡perijunctional ¡region ¡ ahead ¡of ¡Schwann ¡cell ¡sprouting. ¡ ¡ � Between ¡day ¡5-‑10, ¡2166 ¡+ve ¡cells ¡(NMJ ¡ capping ¡cells) ¡start ¡to ¡become ¡restricted ¡to ¡ endplates. ¡ ¡ ¡ � By ¡day ¡28 ¡– ¡cells ¡highly ¡restricted. ¡ ¡ ¡
Process ¡of ¡regeneration ¡following ¡ denervation ¡or ¡paralysis. ¡ � Terminal ¡Schwann ¡cells ¡– ¡path ¡finding ¡ role ¡in ¡compensatory ¡sprouting ¡ following ¡nerve ¡injury ¡ � 2166+ve ¡cells ¡also ¡spread ¡following ¡ denervation, ¡paralysis ¡or ¡atrophy. ¡ � Partially ¡denervated ¡muscle ¡(TS) ¡ ¡ stained ¡with ¡nestin ¡(marker ¡for ¡reactive ¡ terminal ¡schwann ¡cells) ¡1-‑6 ¡days. ¡3 ¡days ¡ to ¡proliferate. ¡ ¡ � 2166 ¡+ve ¡cells ¡show ¡excessive ¡ spreading ¡within ¡24 ¡hours ¡(D-‑F) ¡ ¡ � Association ¡between ¡schwann ¡cells ¡and ¡ 2166 ¡+ve ¡cells ¡at ¡3 ¡days. ¡ ¡Instructive ¡ signal? ¡ ¡ Fig. ¡5D-‑F ¡
Do ¡kranocytes ¡play ¡and ¡instructive ¡or ¡a ¡passive ¡ role ¡in ¡the ¡activation ¡of ¡terminal ¡Schwann ¡cells ¡ and ¡their ¡consequent ¡sprouting? ¡ ¡ � Passive ¡role. ¡ Bromodeoxyuridine ¡incorporation ¡indicates ¡the ¡activation, ¡ proliferation ¡and ¡spread ¡of ¡capping ¡cells ¡following ¡denervation. ¡ ¡ BrdU ¡injected ¡into ¡denervated ¡TS ¡muscles ¡of ¡mice ¡– ¡7% ¡showed ¡ incorporation, ¡However ¡>65% ¡were ¡within ¡40 µm ¡of ¡NMJ. ¡ ¡ Fig. ¡5G ¡ ¡ ¡ Botulinum ¡toxin ¡type ¡A ¡injected ¡inbetween ¡ intercostal ¡muscles ¡and ¡TS ¡muscle ¡to ¡create ¡ neuromuscular ¡block. ¡ ¡ ¡ A ¡– ¡1 ¡day ¡after ¡paralysis ¡2166+ve ¡cells ¡proliferate ¡ ¡ B ¡– ¡not ¡till ¡6 ¡days ¡after ¡paralysis ¡do ¡schwann ¡cells ¡ proliferate. ¡ ¡Therefore ¡not ¡trigger ¡– ¡possible ¡ chemical ¡signal ¡to ¡help ¡facilitate ¡reaction. ¡ ¡
Although ¡NOT ¡A ¡TRIGGER, ¡may ¡lay ¡down ¡a ¡substrate ¡to ¡promote ¡Schwann ¡cell ¡ spread ¡and ¡proliferation ¡– ¡Possibly ¡by ¡secreting ¡molecules ¡that ¡contribute ¡to ¡ the ¡extracellular ¡matrix ¡and ¡provide ¡a ¡pathway ¡. ¡ � Fig ¡8B ¡– ¡ ¡ ¡ 1) ¡ Kranocyte ¡sprouting ¡ to ¡ reinforce ¡bridges ¡ 2) ¡ Schwann ¡cell ¡sprouting ¡ utilises ¡these ¡bridges ¡ ¡ 3) ¡ Axonal ¡sprouting ¡ and ¡ regeneration. ¡ ¡
Is ¡inactivity ¡through ¡paralysis ¡or ¡ denervation ¡necessary ¡for ¡reaction? ¡ ¡ � Capping ¡cells ¡in ¡TS ¡muscles ¡of ¡R6/2 ¡mice ¡studied ¡ (profound ¡muscle ¡atrophy) ¡therefore ¡any ¡difference ¡ due ¡to ¡myogenic/ ¡non ¡neural ¡explanation. ¡(No ¡ abnormality ¡with ¡Schwann ¡cells ¡or ¡nerve ¡terminals). ¡ ¡ � PARALYSIS ¡NOT ¡NECESSARY ¡– ¡distribution ¡of ¡2166 ¡ positive ¡cells ¡indistinguishable ¡to ¡that ¡following ¡ paralysis ¡or ¡denervation. ¡ ¡ Fig ¡6 ¡(C,D) ¡– ¡atrophy ¡is ¡sufficient ¡for ¡ proliferation ¡and ¡spread. ¡
Molecules ¡involved ¡ ¡ � Tenascin-‑ ¡C ¡ – ¡ early ¡molecular ¡ marker ¡in ¡axonal ¡ sprouting ¡and ¡ regeneration. ¡ Association ¡with ¡ spread ¡of ¡2166 ¡+ve ¡ cells ¡(A-‑C) ¡but ¡ tenascin-‑ ¡C ¡null ¡ mutant ¡mouse ¡ shows ¡not ¡ necessary ¡for ¡ accumulation ¡of ¡ cells ¡to ¡NMJs ¡ during ¡ development ¡(F,G). ¡ ¡
Conclusions ¡ -‑ 4 th ¡Cellular ¡component ¡of ¡the ¡neuromuscular ¡junction. ¡ ¡ ¡ -‑ Distinct ¡cell ¡type ¡– ¡lying ¡outside ¡basal ¡lamina. ¡ ¡ ¡ -‑ Compensatory ¡response ¡to ¡denervation, ¡paralysis ¡and ¡atrophy. ¡ Involved ¡in ¡neuromuscular ¡synaptic ¡development, ¡maintenance ¡ and ¡regeneration ¡of ¡damaged ¡axons ¡via ¡sprouting. ¡ ¡ ¡ -‑ Proliferation ¡occurs ¡before ¡Schwann ¡cell ¡proliferation ¡and ¡spread ¡ and ¡axonal ¡sprouting, ¡therefore ¡may ¡lay ¡down ¡a ¡substrate ¡to ¡ facilitate ¡axonal ¡sprouting ¡but ¡does ¡not ¡act ¡as ¡a ¡trigger. ¡ ¡ ¡ -‑ Cellular ¡and ¡Molecular ¡target ¡for ¡effective ¡treatment ¡of ¡ neuromuscular ¡diseases ¡ ¡
Fig. ¡4. ¡ Video ¡rendering ¡of ¡NMJ ¡capping ¡cell ¡ ¡
Strengths ¡/ ¡Weaknesses ¡of ¡paper ¡ Strengths ¡ ¡ Weaknesses ¡ ¡ ¡ Lots ¡more ¡questions ¡to ¡be ¡answered. ¡ Identified ¡new ¡cellular ¡component. ¡ ¡Allows ¡ Understanding ¡incomplete. ¡ ¡ researchers ¡to ¡focus ¡more ¡attention ¡onto ¡ • Mechanism ¡and ¡function ¡of ¡restriction ¡ this ¡molecule ¡to ¡find ¡the ¡missing ¡ to ¡motor ¡endplates ¡ ¡ information. ¡ ¡ • Significance ¡of ¡proliferation ¡and ¡spread ¡ ¡ ¡ ¡ Therapeutic ¡target ¡– ¡help ¡with ¡early ¡axonal ¡ Identity ¡of ¡2166 ¡antigen ¡still ¡unknown. ¡More ¡ injury, ¡synaptic ¡toxicity ¡and ¡other ¡ stringent ¡fractionation ¡or ¡proteomic ¡analysis ¡ neurodegenerative ¡diseases ¡– ¡ALS/ ¡SMA ¡ ¡ necessary. ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ Not ¡possible ¡to ¡double-‑stain ¡NMJ ¡capping ¡ ¡ cells ¡with ¡2166 ¡and ¡HM-‑24 ¡because ¡both ¡ raised ¡in ¡rabbits. ¡Same ¡component? ¡ ¡ ¡ Not ¡the ¡perfect ¡treatment ¡in ¡all ¡cases ¡-‑ ¡ Disturbances ¡in ¡other ¡parts ¡of ¡neuron ¡can ¡ have ¡immediate ¡effects ¡on ¡otherwise ¡ healthy ¡nerve ¡terminals. ¡ ¡ Small ¡volume ¡of ¡tissue ¡they ¡comprise ¡makes ¡ analysis ¡difficult ¡ ¡ ¡ Studied ¡in ¡mice ¡– ¡can ¡this ¡research ¡definitely ¡ be ¡translated ¡into ¡human ¡models? ¡ ¡ ¡ ¡
Further ¡Research… ¡ � CTB ¡– ¡Can ¡presently ¡only ¡knock ¡out ¡motor ¡nerve ¡terminals, ¡ schwann ¡cells ¡and ¡kranocytes. ¡ ¡ Selective ¡ablation ¡of ¡kranocytes ¡ would ¡be ¡advantegeous ¡to ¡study ¡long ¡term ¡effects ¡of ¡this. ¡ ¡ � Further ¡research ¡into ¡ pluripotential ¡capacity ¡of ¡neuromuscular ¡ kranocytes ¡ – ¡regeneration?. ¡ ¡ � Kranocyte ¡fate ¡in ¡various ¡models ¡of ¡disease ¡– ¡ALS ¡ ¡ � Harness ¡cell ¡secretions ¡– ¡neuroprotective ¡factors ¡to ¡prevent ¡ neuromuscular ¡disease ¡ ¡ � New ¡techniques ¡– ¡brainbow? ¡ ¡ � Addition ¡of ¡supportive ¡cells ¡such ¡as ¡schwann ¡cells ¡and ¡ kranocytes ¡to ¡co-‑cultures ¡may ¡enhance ¡synaptogenesis ¡and ¡ maintain ¡any ¡putative ¡synapses ¡that ¡form. ¡ ¡
Early ¡Vulnerability ¡to ¡Ischemia/ Repurfusion ¡Injury ¡in ¡Motor ¡ Terminals ¡Innterva3ng ¡Fast ¡Muscles ¡ of ¡SOD1-‑G93A ¡Mice. ¡ ¡ David ¡G, ¡Nguyen ¡K, ¡Barret ¡EF ¡
Are ¡there ¡early ¡events ¡at ¡the ¡NMJ ¡ that ¡precede ¡motor ¡neuron ¡death ¡in ¡ ALS? ¡
Amytrophic ¡Lateral ¡Sclerosis ¡ • Most ¡common ¡form ¡of ¡Motor ¡ Neurone ¡disease. ¡It ¡affects ¡men ¡ more ¡than ¡women. ¡ ¡ • Cells ¡that ¡innervate ¡muscle ¡cells ¡ directly ¡die ¡first, ¡followed ¡by ¡higher ¡ order ¡motor ¡neurons. ¡ • It ¡affects ¡the ¡neurons ¡which ¡ innervate ¡skeletal ¡or ¡‘voluntary’ ¡ muscle. ¡This ¡can ¡be ¡divided ¡into ¡2 ¡ types. ¡ ¡ • Most ¡commonly ¡is ¡sporadic ¡with ¡no ¡ known ¡cause. ¡Genes ¡have ¡been ¡ iden3fied ¡in ¡familial ¡ALS, ¡but ¡ mechanism ¡is ¡unknown . ¡
Early ¡vulnerability ¡to ¡ischaemia/reperfusion ¡ injury ¡in ¡motor ¡terminals ¡innerva3ng ¡fast ¡ muscles ¡of ¡SOD1-‑G93A ¡mice. ¡ • In ¡vivo. ¡ • Common ¡animal ¡model ¡of ¡fALS ¡ • Focus ¡on ¡the ¡NMJ. ¡ • Differen3al ¡suscep3bility ¡amongst ¡muscle ¡types? ¡ • Oxida3ve ¡stress ¡to ¡induce ¡damage. ¡ ¡
What ¡do ¡we ¡want ¡to ¡know? ¡ • Are ¡motor ¡terminals ¡in ¡the ¡mouse ¡model ¡ more ¡vulnerable ¡to ¡I/R ¡injury ¡than ¡in ¡wild ¡ type? ¡ • When ¡does ¡this ¡first ¡become ¡evident? ¡ • Are ¡motor ¡terminals ¡that ¡innervate ¡different ¡ muscle ¡types ¡differen3ally ¡sensi3ve ¡to ¡this ¡ injury? ¡ • Could ¡there ¡be ¡early ¡events ¡at ¡the ¡NMJ ¡that ¡ quicken ¡or ¡trigger ¡disease ¡progression? ¡
Experimental ¡Design ¡ • Transgenic ¡mouse ¡model ¡ was ¡used. ¡ • SOD1 ¡has ¡been ¡implicated ¡ in ¡fALS. ¡ • Wildtype ¡mice ¡and ¡ contralateral ¡unstressed ¡ muscles ¡were ¡used ¡as ¡ controls. ¡ • I/R ¡injury ¡imposes ¡an ¡ oxida3ve ¡stress. ¡ • Flurorescent ¡labels ¡helped ¡ to ¡iden3fy ¡axons ¡and ¡ endplates. ¡
Are ¡we ¡really ¡examining ¡the ¡results ¡ of ¡oxida3ve ¡stress? ¡ ¡
What ¡could ¡it ¡possibly ¡teach ¡us? ¡ • It ¡could ¡show ¡us ¡what ¡happens ¡before ¡motor ¡ nerve ¡degenera3on ¡ • It ¡could ¡give ¡us ¡possible ¡medical ¡interven3ons ¡ or ¡diagnos3c ¡tools ¡ • It ¡could ¡give ¡us ¡insight ¡into ¡the ¡mechanism ¡of ¡ familial ¡ALS ¡which ¡is ¡unknown ¡ • Could ¡clear ¡up ¡the ¡ques3on ¡of ¡whether ¡the ¡ result ¡of ¡the ¡SOD1 ¡muta3on ¡is ¡loss ¡of ¡func3on ¡ or ¡gain ¡of ¡func3on ¡
What ¡did ¡they ¡find? ¡
Increased ¡sensi/vity ¡to ¡I/R ¡injury ¡was ¡present ¡at ¡an ¡early ¡age ¡ ¡ in ¡fast ¡muscles ¡of ¡SOD1-‑G93A ¡ ¡mice . ¡ ¡ ¡
Motor ¡terminals ¡innerva/ng ¡fast ¡muscle ¡were ¡more ¡vulnerable ¡to ¡ I/R ¡injury ¡than ¡those ¡innerva/ng ¡slow ¡muscle ¡ ¡ ¡
Plantaris ¡Muscle ¡ • Magitude ¡of ¡I/R ¡induced ¡injury ¡was ¡similar ¡to ¡ EDL ¡and ¡more ¡than ¡soleus. ¡ • Possibly ¡a ¡general ¡property ¡of ¡fast ¡hindlimb ¡ muscles ¡ • Only ¡2 ¡mice ¡were ¡studied. ¡
Their ¡conclusions ¡ 1. Varying ¡vulnerability ¡of ¡motor ¡terminals ¡was ¡associated ¡ with ¡the ¡animal ¡model ¡of ¡the ¡disease. ¡ 2. The ¡increased ¡sensi3vity ¡was ¡present ¡before ¡neuron ¡ degenera3on ¡ 3. The ¡early ¡vulnerability ¡shown ¡by ¡fast ¡muscle ¡motor ¡ terminals ¡may ¡contribute ¡to ¡early ¡events ¡in ¡motor ¡neuron ¡ death. ¡ 4. Fast ¡muscle ¡motor ¡neuron ¡terminals ¡degenerate ¡before ¡ motor ¡terminals ¡that ¡innervate ¡slow ¡ac3ng ¡muscle. ¡ 5. Fast ¡fa3guable ¡motor ¡neurons ¡might ¡be ¡more ¡vulnerable ¡ as ¡they ¡innervate ¡more ¡muscle ¡types. ¡ 6. High ¡levels ¡of ¡anaerobic ¡exercise ¡(shown ¡by ¡the ¡I/R ¡stress) ¡ might ¡contribute ¡to ¡rapid ¡disease ¡progression. ¡ ¡
Strengths? ¡Weaknesses? ¡ • Focused ¡on ¡hindlimb. ¡ • SOD1-‑G93A ¡model ¡ • 2 ¡mice ¡for ¡plantaris ¡muscle ¡study ¡ • Enough ¡of ¡a ¡focus ¡on ¡metabolism? ¡ • Clear. ¡Well ¡presented. ¡ • What ¡does ¡this ¡mean ¡for ¡disease ¡sufferers? ¡ ¡
Further ¡research? ¡What ¡do ¡we ¡know ¡ now? ¡ • ‘We ¡propose ¡that ¡the ¡primary ¡pathogenic ¡event, ¡ determining ¡the ¡survival ¡of ¡the ¡animal, ¡is ¡not ¡ motor ¡neuron ¡death ¡itself, ¡but ¡rather ¡the ¡loss ¡of ¡ motor ¡neuron/muscle ¡contacts’ ¡ • What ¡happens ¡if ¡we ¡protect ¡motor ¡terminals? ¡ ¡ • Local ¡effects? ¡ • NMJ ¡is ¡lost ¡before ¡the ¡motor ¡neuron. ¡ • Role ¡of ¡the ¡synapse? ¡ • Role ¡of ¡lipid ¡metabolism? ¡ ¡ ¡
Model ¡of ¡fALS ¡disease ¡progression ¡
‘Morphological ¡Characteris2cs ¡of ¡ Motor ¡Neurones ¡Do ¡Not ¡ Determine ¡Their ¡Rela2ve ¡ Suscep2bility ¡to ¡Degenera2on ¡in ¡ a ¡Mouse ¡Model ¡of ¡Severe ¡Spinal ¡ Muscular ¡Atrophy ¡(SMA)’ ¡
Spinal ¡Muscular ¡Atrophy ¡(SMA) ¡ ¡ • Most ¡common ¡childhood ¡form ¡of ¡Motor ¡ Neuron ¡Disease, ¡incidence ¡of ¡1:6000-‑1:10000 ¡ live ¡births. ¡ • Leads ¡to ¡muscle ¡atrophy, ¡paralysis ¡and ¡ premature ¡death. ¡ • Caused ¡by ¡gene3c ¡defect ¡in ¡SMN1 ¡gene ¡that ¡ codes ¡Survival ¡Motor ¡Neurone ¡Protein. ¡
Background ¡ • SMA ¡is ¡related ¡to ¡ALS ¡ • Evidence ¡SMA ¡and ¡ALS ¡share ¡biochemical ¡ pathways ¡ • In ¡ALS ¡suggested ¡that ¡morphological ¡neuronal ¡ proper3es ¡influenced ¡suscep3bility ¡to ¡ degenera3on ¡ • Aim-‑ ¡‘determine ¡whether ¡intrinsic ¡morphological ¡ characteris3cs ¡of ¡motor ¡neurones ¡influenced ¡ their ¡rela3ve ¡vulnerability ¡to ¡SMA’ ¡ ¡
Structure ¡of ¡Study ¡ Experiments ¡ 1. Muscle ¡loca3on/nerve ¡stump ¡length/fibre ¡type ¡ 2. Intrinsic ¡morphological ¡characteris3cs ¡(motor ¡unit ¡ size, ¡arbor ¡length, ¡size/form ¡of ¡NMJ, ¡branching ¡ paZern) ¡ 3. ¡Synap3c ¡Plas3city ¡ 4. ¡Schwann ¡Cells ¡ ¡ Outcome-‑ ¡ ’Morphological ¡characteris3cs ¡of ¡motor ¡ neurones ¡are ¡not ¡a ¡major ¡determinant ¡of ¡disease-‑ suscep3bility ¡in ¡SMA, ¡in ¡contrast ¡ALS’ ¡ ¡ ¡
Methods ¡ Mice ¡ • Neonatal ¡Mice ¡Smn-‑/-‑;SM2 ¡and ¡22 ¡ week ¡old ¡healthy ¡Thy.1-‑YFP-‑H ¡mice. ¡ ¡ Muscles ¡ • 10 ¡dis3nct ¡anatomical ¡muscles, ¡ from ¡cranial, ¡torso ¡and ¡hindlimb ¡ regions. ¡ ¡ • Characterised ¡as ¡vulnerable ¡or ¡ disease ¡resistant ¡by ¡occupancy ¡ counts ¡
Methods ¡ Part ¡1 . ¡Smn-‑/-‑;SMN2 ¡severe ¡ mouse ¡model. ¡An3bodies ¡raised ¡ against ¡neurofilaments. ¡ ¡ Part ¡2. ¡Healthy ¡Adult ¡Thy.1-‑YFP-‑H ¡ mice. ¡Reconstruc3on ¡whole ¡ motor ¡units ¡by ¡montaging ¡ fluorescent ¡micrographs ¡in ¡ PhotoShop ¡and ¡analysis ¡using ¡ ImageJ ¡sohware. ¡ ¡ ¡
Methods ¡ ¡ Part ¡3. ¡Primary ¡An3bodies ¡against ¡ neurofilaments. ¡Quan3ta3ve ¡analysis ¡comparing ¡ % ¡of ¡polyinnervated ¡NMJ ¡at ¡P7 ¡and ¡P14. ¡Using ¡ mouse ¡model ¡Smn-‑/-‑;SMN2. ¡ ¡ ¡ Part ¡4. ¡Terminal ¡Schwann ¡Cells ¡labelled ¡in ¡wild ¡ type ¡mice ¡using ¡primary ¡an3bodies ¡against ¡S100 ¡ protein. ¡Qualita3ve ¡and ¡Quan3ta3ve ¡analysis. ¡ ¡ ¡
Skeletal ¡Muscle ¡Loca3on ¡ • Posi3on ¡of ¡the ¡ muscle ¡in ¡the ¡body ¡ • Nerve ¡stump ¡length ¡ • Muscle ¡fibre ¡type ¡
Motor ¡Unit ¡Size ¡and ¡Muscle ¡Arbor ¡ Length ¡
NMJ ¡Synapses ¡
Branching ¡PaZern ¡
Synap3c ¡Plas3city ¡ ¡
Recommend
More recommend
