Manchester Institute of Biotechnology Discovery through innovation @RoyGoodacre ¡ www.biospec.net ¡ @Metabolomics ¡ Lessons learnt from HUSERMET The Human Serum Metabolome Project Roy Goodacre and friends The Manchester Institute of Biotechnology is committed to the pursuit of research excellence, education, knowledge transfer and discovery through innovation whereby a coherent and integrated interdisciplinary research community work towards developing new biotechnologies that will find applications in areas such as human health, the energy economy, food security, industrial transformations and the environment.
www.husermet.org ¡ Funded ¡by ¡and ¡in ¡collabora/on ¡with: ¡ Department ¡of ¡Trade ¡ ¡ and ¡Industry ¡
2x ¡LECO ¡GC-‑TOF-‑MS ¡ MS ¡pla;orms ¡in ¡Mcr ¡ • Microbial ¡ n Plant ¡ – cell ¡extracts ¡ Ø ?ssues ¡ ¡ – metabolic ¡footprint ¡ Ø fruit ¡extracts ¡ Waters ¡GCT-‑MS ¡ – vola?les ¡ Ø vola?les ¡ • Mammalian ¡ – serum/plasma, ¡urine, ¡?ssues, ¡vola?les ¡ – cell/?ssue ¡cultures ¡ – media ¡(metabolic ¡footprint) ¡ 2x ¡UPLC-‑LTQ-‑Orbitrap ¡XL ¡MS ¡ + ¡Waters ¡LCT ¡+ ¡Agilent ¡Q 3 ¡
LESSON ¡I ¡ Mass ¡Spectrometers ¡AND ¡Chromatography ¡driM ¡
QCs ¡allow ¡signal ¡assessment ¡ QC 1 QC 2 Real: QC 3 QC 4 60 serum (healthy). QC 5 QC 6 QA: QC 7 sigma serum. QC 8 QC 9 Spike1: QC 10 blank glutaric acid, citric column test solution acid, alanine, sample 1 sample 2 glycine, leucine, sample 3 phenylalanine, and sample 4 tryptophan. sample 5 QC 11 [each at 0.16 mg mL -1 ] sample 6 sample 7 Spike 2: sample 8 caffeine & nicotine. sample 9 sample 10 [each at 0.16 mg mL -1 ] QC 12 sample 11 Begley ¡P. ¡ et ¡al . ¡(2009) ¡ Analy)cal ¡Chemistry ¡ 71, ¡7038-‑7046 ¡
QCs ¡allow ¡signal ¡correc?on ¡ Instrument ¡annual ¡ ¡ maintenance ¡ QC 1 Sample ¡ QC 2 QC ¡ QC 3 Before: ¡ QC 4 QC 5 QC 6 QC 7 QC 8 QC 9 QC 10 blank column test solution sample 1 AMer: ¡ sample 2 sample 3 sample 4 sample 5 QC 11 sample 6 sample 7 sample 8 sample 9 sample 10 QC 12 sample 11 Dunn ¡W. ¡ et ¡al . ¡(2011) ¡ Nature ¡Protocols ¡ 6, ¡1060-‑1083 ¡
reference map of normal HUSERMET ¡ ¡pipeline ¡ Admin BiologicalSource Growth +User +Genotype +Treatment +Experiment +Source +Environment biomarker Multiple samples - SampleHandling Collection +Explant +Collection +Sample Biobank for future +Event discovery studies SamplePreparation AnalysisSpecificSamplePreparation +Aliquot +PreparationMethod +AnalysisMaterial +Procedure InstrumentalAnalysis +Machine +Run metadata capture MetabolomeEstimate +Output +DataPoint SOP metabolomics curation N=1000s SOP C C D D SOPs C C QCs C C C C
reference map of normal HUSERMET ¡ ¡pipeline ¡ and ¡data ¡analysis ¡ Admin BiologicalSource Growth +User +Genotype +Treatment +Experiment +Source +Environment biomarker SampleHandling Collection +Explant +Collection +Sample +Event discovery SamplePreparation AnalysisSpecificSamplePreparation +Aliquot +PreparationMethod +AnalysisMaterial +Procedure InstrumentalAnalysis +Machine +Run MetabolomeEstimate +Output +DataPoint • Normal ¡popula?ons: ¡ • Stockport ¡PCT ¡ • GSK, ¡EMAS ¡ • 1200 ¡subjects: ¡ • Took ¡18 ¡months ¡ Brown, ¡M. ¡ et ¡al . ¡(2005) ¡ Metabolomics ¡ 1 , ¡39-‑51 ¡ Mamas, ¡M. ¡et ¡al . ¡(2011) ¡ Arch. ¡Toxicology ¡ 85 , ¡5-‑17 ¡ Goodacre, ¡R. ¡ et ¡al . ¡(2007) ¡ Metabolomics ¡ 3 , ¡231-‑241 ¡
Q: ¡Did ¡the ¡QC ¡correc?on ¡work? ¡ • Discriminant ¡ analysis ¡ • Abemp?ng ¡to ¡ separate ¡the ¡ 10 ¡batches ¡ • A: ¡Yes! ¡ !
Clinical ¡Chemistry ¡ versus ¡LC-‑MS ¡
Clinical ¡Chemistry ¡ versus ¡GC-‑MS ¡ microbial ¡ drugs ¡ food ¡
Q: ¡How ¡fast ¡did ¡we ¡get ¡to ¡this ¡point? ¡ A: ¡A ¡lot ¡slower ¡than ¡expected!!! ¡ hbp://searchengineland.com/figz/wp-‑content/seloads/2014/08/speed-‑slow-‑snails-‑ss-‑1920-‑800x450.jpg ¡
LESSON ¡II ¡ Need ¡to ¡control ¡experimental ¡design ¡
Data ¡analysis ¡ ‘slide’/‘pipeline’ ¡ Databases: data + metadata Ronald A. Fisher (1938) Pre-processing “To call in the statistician after the experiment is done may be no more than Analysis + validation asking him to perform a post-mortem examination: he may be able to say what Visualisation the experiment died of” * and this is why most claimed Interpretation research findings are false *Broadhurst, D. & Kell, D.B. (2006) Metabolomics 2 , 171-196
Poste ¡G. ¡(2011) ¡Bring ¡on ¡the ¡biomarkers. ¡ Nature ¡ 469 , ¡156-‑157 ¡
Nature ¡ 469 , ¡156-‑157 ¡
Most ¡data ¡analyses ¡are ¡Supervised ¡ • Powerful! ¡But ¡they ¡do ¡make ¡mistakes! ¡ • Can ¡you ¡spot ¡the ¡difference? ¡ • Must ¡use ¡sta?s?cal ¡valida?on ¡
Sta?s?cian ¡needed ¡at ¡onset ¡ • Was ¡randomisa?on ¡ successful: ¡Check! ¡ • In ¡case-‑control ¡studies ¡ only ¡non-‑random ¡thing ¡ should ¡be ¡what ¡you ¡ are ¡tes?ng ¡for ¡ Ransohoff, ¡D.R. ¡(2005) ¡ Nature ¡Reviews ¡Cancer ¡ 5 , ¡142-‑149 ¡
LESSON ¡II ¡ Biological ¡inference ¡possible ¡
Age ¡effects: ¡clinical ¡metadata ¡
Ageing: ¡glycolysis ¡and ¡TCA ¡ 2-‑way ¡ANOVA; ¡age ¡& ¡gender: ¡ F (1,779)=79.8, ¡ p =3.1x10 -‑18 ¡ Figure: ¡Levine ¡A.J. ¡& ¡Puzio-‑Kuter, ¡A.M. ¡(2010) ¡ ¡ Science ¡ 330 , ¡1340-‑1344 ¡
Gender ¡effects ¡ • Seen ¡previously ¡ – 4-‑hydroxyphenyllac?c ¡acid, ¡ crea?nine, ¡citrate, ¡urate, ¡ glycerol, ¡hexadecenoic ¡acid ¡ • Higher ¡in ¡Females ¡ – Caffeine: ¡food ¡consump?on ¡ – 2-‑aminomalonic ¡acid: ¡ associated ¡with ¡ atherosclero?c ¡plaques ¡ – glycerol, ¡+ ¡glyceric ¡acid, ¡ glycerol-‑3P: ¡glycerolipid ¡and ¡ glycerophospholipid ¡synthesis ¡ Marker ¡of ¡oxida?ve ¡stress; ¡oxida?on ¡product ¡of ¡methionine ¡ ¡ 2-‑way ¡ANOVA ¡on ¡gender: ¡ ¡ F (1,901)=20.3, ¡ p =7.7x10 -‑6 ¡
Gender ¡and ¡age ¡effects ¡ 2-‑way ¡ANOVA ¡ ¡ ¡ ¡Age ¡(<50 ¡ vs . ¡>64 ¡y): ¡ F (1,788)=39.1 ¡ F (1,778)=11.7 ¡ ¡ p =6.8x10 -‑10 ¡ ¡p =0.0007 ¡ ¡ ¡ ¡Gender ¡ ¡ F (1,788)=55.4 ¡ ¡ ¡p =2.6x10 -‑13 ¡
BMI: ¡Body ¡Mass ¡Index ¡ less than 25 vs . greater than 30 PCA ¡ GC-‑MS ¡ UPLC-‑MS(-‑) ¡ UPLC-‑MS(+) ¡ PLS ¡
BMI: ¡Body ¡Mass ¡Index ¡ less than 25 vs . greater than 30 MANY ¡OTHERS ¡ • Phospholipids ¡incl. ¡ sphingolipids ¡and ¡PCs ¡ • Lac?c ¡acid ¡ • Deoxy ¡sugars ¡and ¡ Amino ¡acids: ¡ ¡ Uric ¡acid ¡ Asparagine, ¡aspartate, ¡cys)ne, ¡cysteine, ¡ sugars ¡ glutamine, ¡his)dine, ¡leucine, ¡ • Faby ¡acids ¡ phenylalanine, ¡serine, ¡tyrosine ¡ oxidised ¡faby ¡acids ¡ (e.g.13,14-‑dihydroxy-‑ docosanoic ¡acid, ¡ tetradecanoic ¡acid) ¡ • glycerol ¡ ¡ Diglycerides ¡ Ubiquinone ¡9 ¡and ¡ubiquinone ¡6 ¡ and ¡Undecaprenyl ¡diphosphate ¡
Many ¡molecular ¡phenotypes ¡ Clinical ¡characteris?cs ¡of ¡the ¡ Husermet ¡cohort ¡ Characteristic * ! ! Gender!(male:female) ! 701:490 ! Age!(median,!IQR) ! 48.0!(40.0,60.0) ! BMI!(median,!IQR) ! 25.63!(23.20,28.71) ! Smokers!(non:ex:current) ! 502:163:176 ! SBP!(median,!IQR),!mmHg ! 125!(115,137) ! DBP!(median,!IQR),!mmHg ! 76!(70,83) ! GLUC!(median,!IQR),!mmol.L P1 ! 4.71!(4.20,5.30) ! CHOL!(median,!IQR),!mmol.L P1 ! 5.10!(4.30,5.80) ! TRIG!(median,!IQR),!mmol.L P1 ! 1.18!(0.80,1.80) ! HDLC!(median,!IQR),!mmol.L P1 ! 1.26!(1.00,1.50) ! LDLC!(median,!IQR),!mmol.L P1 ! 3.2!(2.54,3.77) ! !
Q: ¡Is ¡size ¡important? ¡ • We ¡measured ¡ 1200 ¡subjects ¡ • Sample ¡size ¡>400 ¡ provides ¡the ¡ greatest ¡accuracy ¡ with ¡highest ¡ precision ¡ A: ¡You ¡Bet! ¡ • Recommend: ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡at ¡least ¡200 ¡ ¡ ¡per ¡class ¡
Factors ¡affec?ng ¡the ¡human ¡metabolome ¡ ¡ Intrinsic factors Extrinsic factors body composition tissue turnover nutrients metabolic rate (at rest) non-nutrients age drugs human genotype physical activity health status microbiome reproductive status mental status Metabolic status diurnal cycle Goodacre, R. (2007) J. Nutrition 137 , 259S-266S.
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