1 1 Our team Menno, Yifan, Mark, Marcel, Isabelle - PowerPoint PPT Presentation

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Our ¡team Menno, ¡Yifan, ¡Mark, ¡Marcel, ¡Isabelle ¡ ¡ Lizah, ¡Stephanie, ¡E;ychia, ¡Lakshmeesh, ¡Sietske ¡ ¡ 2 ¡ 2 ¡

Our ¡project: ¡Snifferomyces What? ¡ -­‑ ¡ ¡Transfer ¡olfactory ¡capabiliHes ¡from ¡mammalian ¡ species ¡to ¡a ¡unicellular ¡chassis ¡ Why? ¡ -­‑ VersaHlity ¡ -­‑ High ¡sensiHvity ¡ -­‑ Possible ¡outputs ¡ How? ¡ -­‑ By ¡making ¡a ¡standard ¡for ¡receptor ¡expression ¡ 3 ¡ 3 ¡

Case ¡Study: ¡Tuberculosis ¡DiagnosHcs ¡ The ¡Need: ¡ -­‑ Over ¡95% ¡of ¡TB ¡related ¡deaths ¡ occur ¡in ¡low-­‑and ¡middle ¡income ¡ countries. 1 ¡ -­‑ Fast ¡and ¡accurate ¡TB ¡diagnosis ¡is ¡ relaHvely ¡expensive. ¡ An ¡alterna.ve ¡cheap ¡and ¡accurate ¡ diagnosis ¡is ¡needed! ¡ Georgies ¡F. ¡Mgode ¡et ¡al. ¡J. ¡Clin. ¡Microbiol. ¡(2012) ¡274-­‑280 ¡ Tuberculosis ¡bacteria ¡picture: ¡Wikipedia ¡ 4 ¡ 4 ¡ Rat ¡picture: ¡McCormack, ¡Gerald ¡(2007) ¡Cook ¡Islands ¡Biodiversity ¡Database ¡ 1: ¡WHO ¡factsheet ¡no. ¡104 ¡

Yeast ¡can ¡serve ¡as ¡chassis ¡ A ¡similar ¡GPCR ¡system ¡in ¡ Saccharomyces ¡cerevisiae ¡ 5 ¡ 5 ¡ Pheromone cascade:Versele et. al. EMBO Rep. (2001) vol. 2 no. 7 pp 574-579

AdaptaHons ¡of ¡the ¡GPCR ¡cascade ¡ Your ¡Favorite ¡Receptor ¡ Pheromone ¡Receptor ¡ Pheromone ¡sensing ¡ ¡ ¡ Olfactory ¡sensing ¡ Δfar1 ¡ Transcrip.on ¡response: ¡GFP ¡ 6 ¡ 6 ¡ Pheromone cascade: Versele et. al. EMBO Rep. (2001) vol. 2 no. 7 pp 574-579

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡Chimeric ¡design ¡ Supercomputing Adapted ¡Niacin ¡receptor ¡ from ¡Zhang ¡server ¡ N ¡terminus ¡and ¡first ¡ Molecular ¡Dynamics ¡ ¡ helix : ¡ Executed ¡by ¡YASARA ¡ Membrane ¡targeHng ¡ sequence ¡ Alignment ¡ ¡ Between ¡human ¡and ¡ ¡ Ac.ve ¡region : ¡ ¡ I7-­‑Rat ¡receptor ¡ Binding ¡niche ¡to ¡ligand ¡ C ¡terminus : ¡ ¡ Increase ¡affinity ¡with ¡ subunits ¡ 7 ¡ 7 ¡ Receptor: ¡Venkat ¡Radhika ¡et ¡al. ¡Nature ¡chem. ¡Biol. ¡V.3 ¡No. ¡6 ¡p. ¡325-­‑330 ¡ J. ¡Zhang: ¡Zhang ¡et ¡all ¡GPCR-­‑ITASSER ¡(2011) ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡TargeHng ¡tuberculosis ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡Wetlab ¡Results Methyl ¡NicoHnate ¡ Receptor ¡ + ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡Reporter ¡ = ¡ ¡Snifferomyces ¡ Tuberculosis ¡bacterium ¡ Niacin ¡ 8 ¡ 8 ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡Design ¡of ¡the ¡Receptor • Rat ¡I7 ¡N-­‑ ¡and ¡C-­‑terminal ¡ends ¡ • FLAG ¡tag ¡ • RestricHon ¡sites ¡ 9 ¡

Receptor ¡is ¡in ¡the ¡membrane Brighhield ¡ Fluorescence ¡ E N Transformant ¡ ¡ A R B M E M T C E R R ! O N C O I T A Z I L A C Fluorescence ¡(AU) ¡ O L Reference ¡ ¡ Distance ¡(pixels) ¡ 10 ¡ 10 ¡

Transformed ¡cells ¡respond • Flow ¡cytometry ¡experiment ¡performed ¡ • DNA ¡stained ¡with ¡fluorescent ¡dye ¡ ! N Reference ¡ ¡ Transformant ¡ Transformant ¡ I C A I N Niacin ¡induced ¡ Uninduced ¡ Niacin ¡induced ¡ O T E S N O P S E R Count ¡ 11 ¡ 11 ¡ Fluorescence ¡

Design ¡of ¡the ¡reporter • FUS1 ¡ promoter ¡induced ¡by ¡the ¡cascade ¡ • EGFP ¡reporter ¡as ¡indicator ¡of ¡the ¡pathway ¡ 12 ¡

Response ¡of ¡the ¡reporter • InducHon ¡with ¡alpha ¡pheromone ¡ • Fluorescence ¡measurements ¡ S • Consistent ¡with ¡Flow ¡Cytometry ¡data ¡ A S K R O W R E T R O P E ! R D E T C E P X E 13 ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡Snifferomyces • Snifferomyces ¡= ¡receptor ¡+ ¡reporter ¡ • Integrated ¡in ¡one ¡single ¡BioBrick ¡ 14 ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡Snifferomyces No ¡ligand ¡ Niacin ¡ ¡ S E C Y M O R E F F ! N I N I C S A I N O T S D N O P S E R Alpha ¡pheromone ¡ • N=400 ¡ • Intensity ¡of ¡250 ¡saturated: ¡pixel ¡saturaHon ¡ 15 ¡

Modeling Results Receptor Pathway Sniffer-O-Meter

Molecular Dynamics Rat-I7 Niacin Receptor Niacin

Molecular Dynamics Rat-I7 Niacin Receptor Methyl nicotinate

Molecular Dynamics Rat-I7 Niacin Receptor Re-engineered (R251K) Methyl nicotinate

Molecular Dynamics Rat-I7 Niacin Receptor Re-engineered (R251K) Methyl nicotinate G N I D N I B D E V O R P M I ! Y G R E N E

QuesHons • Does ¡the ¡ FUS1-­‑EGFP ¡ reporter ¡give ¡a ¡ quanHtaHve ¡response ¡to ¡the ¡input? ¡ • How ¡long ¡does ¡it ¡take ¡before ¡you ¡can ¡see ¡a ¡ response? ¡ 21 ¡ 21 ¡

Pathway ¡Model • Literature ¡study 1,2 ¡ – Complex ¡(too ¡many ¡ parameters) ¡ • Model ¡simplificaHon ¡ ¡ – 17 ¡species, ¡21 ¡parameters ¡ • SensiHvity ¡analysis ¡based ¡ parameter ¡esHmaHon ¡ • NegaHve ¡eigenvalues ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡  ¡stable ¡and ¡realizable ¡system ¡ ¡ ¡ 1: ¡T. ¡Yi ¡et ¡al. ¡PNAS(2003) ¡vol. ¡100 ¡no. ¡19 ¡ ¡ 22 ¡ 22 ¡ 2: ¡Kofahl ¡et ¡al. ¡Yeast ¡(2004) ¡vol ¡21. ¡831-­‑850 ¡

Model ¡predicHons Predicted ¡ Measured ¡ 23 ¡ 23 ¡

Answers • Does ¡the ¡ FUS1-­‑EGFP ¡ reporter ¡give ¡a ¡quanHtaHve ¡response ¡to ¡ the ¡input? ¡ – Yes ¡ • How ¡long ¡does ¡it ¡take ¡before ¡you ¡can ¡see ¡a ¡response ¡? ¡ – IniHal ¡response ¡~ ¡20 ¡min ¡ – Peak ¡response ¡~ ¡2.5 ¡hrs ¡ 24 ¡ 24 ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡Ethics-­‑based ¡design ¡approach ¡ • Who ¡is ¡this ¡tool ¡for? ¡Can ¡they ¡afford ¡it? ¡ • Does ¡the ¡tool ¡need ¡to ¡be ¡operated ¡by ¡trained ¡ professionals? ¡ • Work ¡jointly ¡with ¡stakeholders ¡to ¡achieve ¡our ¡ end ¡result. ¡ 25 ¡ 25 ¡

Royal Marechaussee ‘’We ¡use ¡a ¡chemical ¡nose ¡that ¡has ¡a ¡lot ¡of ¡false ¡posiHves, ¡how ¡is ¡ this ¡in ¡your ¡device?’’ ¡ 26 ¡ 26 ¡

SensiHvity ¡& ¡Specificity • Biological ¡funcHons ¡are ¡ inherently ¡stochasHc ¡ • Analysis ¡for ¡false ¡posiHves ¡ and ¡false ¡negaHves ¡ 27 ¡ 27 ¡

SensiHvity ¡& ¡Specificity 28 ¡ 28 ¡

InformaHon ¡Processing ¡Capacity ¡ Automatic image acquisition Automatic ! 8 . image 0 F O processing T I B O I B 29 ¡ 29 ¡ [1] Cheong et al.,Science, 334 (6054): 354-358 (2011) [2] Colman-Lerner et al,Nature 437, 699-706 (2005)

Sniffer-­‑O-­‑Meter ¡ Contained ¡environment ¡ • RelaHvely ¡cheap: ¡under ¡5 ¡euros ¡ • N A C R E T E M ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡Medium ¡ - O - R E ! L F A F N I N G S I S P F G T C E T E D TagGFP2 ¡E.coli ¡ “Much more research is needed before we can use this in the medical field, but the beginning of this project will probably lead up to a new detection method” Dr. Rene Lutter, Academical Centre University of Amsterdam 30 ¡ 30 ¡ 30 ¡

Achievements 31 ¡

Achievements ¡Wetlab Receptor ¡ • Membrane ¡targeHng ¡ • Response ¡to ¡niacin ¡ Reporter ¡ • QuanHtaHve ¡response ¡to ¡input ¡ Snifferomyces ¡ • GFP ¡output ¡in ¡response ¡to ¡niacin ¡ • Build ¡your ¡own ¡receptor ¡protocol ¡ 32 ¡ 32 ¡

Achievements ¡Modeling By ¡using ¡a ¡broad ¡spectrum ¡of ¡techniques ¡(PDE, ¡ODE, ¡SDE, ¡ ¡MD, ¡ informaHon ¡theory), ¡we ¡have ¡developed ¡models ¡spanning: ¡ • The ¡molecular ¡level ¡(structural ¡model, ¡MD) ¡ – Improved ¡binding ¡affinity ¡for ¡methyl ¡nicoHnate ¡ • The ¡cellular ¡level ¡(ODE, ¡SDE) ¡ – Pathway ¡model ¡reproduced ¡and ¡elucidated ¡lab ¡results ¡ – StochasHc ¡model ¡developed ¡for ¡specificity ¡and ¡sensiHvity ¡analysis ¡ • The ¡populaHon ¡level ¡(PDE, ¡informaHon ¡theory) ¡ – CalculaHons ¡have ¡shown ¡need ¡for ¡populaHon ¡ ¡ – Proof-­‑of-­‑concept ¡has ¡led ¡to ¡devising ¡the ¡Sniffer-­‑O-­‑Meter 33 ¡ 33 ¡ 33 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡