Using imaging to measure neural Outline: ac5vity 1. - PDF document

2/28/13 ¡ Using ¡imaging ¡to ¡measure ¡neural ¡ Outline: ¡ ¡ ac5vity ¡ 1. History ¡and ¡principles ¡of ¡neuroimaging ¡ ¡ 2. Review ¡three ¡different ¡types ¡of ¡imaging ¡ Dr. ¡Shelby ¡Dietz ¡ 1. Voltage-­‑sensi5ve ¡indicators ¡ Neurobiology ¡and ¡Behavior ¡ 2. Calcium ¡indicators ¡ Cornell ¡University ¡ 3. Synap5c ¡release ¡indicators ¡ 3. Focus ¡on ¡one ¡imaging ¡project: ¡the ¡locomotor ¡CPG ¡ February ¡27, ¡2013 ¡ What ¡is ¡neuroimaging? ¡ The ¡applica5on ¡of ¡op5cal ¡techniques ¡to ¡study ¡nerve ¡ 5ssue. ¡ What ¡do ¡we ¡mean ¡by ¡ac5vity? ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ Ramon ¡y ¡Cajal, ¡1911 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡KeYunan ¡et ¡al. ¡2002 ¡ An ¡updated ¡defini5on ¡of ¡neuroimaging: ¡the ¡applica5on ¡of ¡op5cal ¡techniques ¡to ¡ study ¡cellular ¡ac5vity ¡in ¡nerve ¡5ssue. ¡ ¡ ¡ 1 ¡

2/28/13 ¡ First ¡op5cal ¡measurements ¡of ¡neural ¡ac5vity ¡1968 ¡ ¡ ¡ Why ¡use ¡imaging? ¡ ¡ ¡ ¡ Advantages ¡of ¡imaging: ¡ ¡ ¡-­‑-­‑ ¡can ¡monitor ¡some ¡proper5es, ¡like ¡chemical ¡concentra5ons, ¡that ¡electrodes ¡ ¡ ¡ ¡can’t ¡ ¡ ¡-­‑-­‑ ¡less ¡invasive ¡than ¡an ¡electrode, ¡can ¡allow ¡for ¡long-­‑term ¡(up ¡to ¡days ¡or ¡ ¡ ¡ ¡weeks) ¡recordings ¡ ¡ ¡-­‑-­‑ ¡can ¡record ¡from ¡mul5ple ¡iden5fied ¡neurons ¡simultaneously ¡ ¡ Effects ¡too ¡ ¡ ¡ small ¡to ¡see ¡ ¡ ¡ individual ¡cells ¡ Advantages ¡of ¡tradi5onal ¡electrophysiology ¡ ¡ ¡-­‑-­‑ ¡higher ¡fidelity, ¡can ¡resolve ¡very ¡small ¡currents ¡or ¡voltage ¡changes ¡at ¡high ¡ ¡ ¡ ¡sampling ¡rates ¡ ¡ ¡ ¡ Func5onal ¡magne5c ¡ ¡ Imaging ¡does ¡not ¡replace, ¡but ¡is ¡complementary ¡to ¡tradi5onal ¡electrophysiology ¡ resonance ¡imaging ¡(fMRI): ¡ ¡ ¡ 1991 ¡ ¡ ¡ ¡ Measure ¡blood ¡oxygen ¡ First ¡op5cal ¡measurements ¡of ¡neural ¡ac5vity ¡1968 ¡ First ¡op5cal ¡measurements ¡of ¡neural ¡ac5vity ¡1968 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ To ¡record ¡the ¡ac5vity ¡of ¡individual ¡cells, ¡must ¡introduce ¡some ¡material ¡with ¡op5cal ¡ What ¡can ¡be ¡used ¡to ¡ ¡ proper5es ¡that ¡change ¡more ¡drama5cally ¡in ¡response ¡to ¡changes ¡in ¡the ¡cell’s ¡ (1) detect ¡changes ¡in ¡single ¡cell ¡proper5es, ¡and ¡ ¡ proper5es. ¡ (2) report ¡that ¡change? ¡ ¡ Report ¡changes ¡with ¡light ¡using ¡FLUOROPHORES ¡ 2 ¡

2/28/13 ¡ Fluorescence ¡microscope ¡configura5on ¡ Fluorophores ¡ ¡ A ¡macromolecule ¡aYached ¡to ¡a ¡chromophore ¡that ¡can ¡fluoresce-­‑-­‑ ¡you ¡excite ¡them ¡by ¡ shining ¡light ¡of ¡one ¡wavelength ¡on ¡them, ¡and ¡they ¡convert ¡those ¡photons ¡to ¡a ¡ different ¡wavelength ¡that ¡you ¡then ¡detect. ¡ If ¡you ¡aYach ¡this ¡ chromophore ¡to ¡ a ¡macromolecule ¡ that ¡changes ¡in ¡ some ¡way ¡when ¡ the ¡cell ¡changes ¡ state, ¡you ¡can ¡ signal ¡that ¡ change ¡in ¡cell ¡ state ¡with ¡a ¡ change ¡in ¡ brightness ¡or ¡ spectrum ¡ ¡ Jablonski ¡diagram ¡ ¡ How ¡to ¡get ¡the ¡fluorophore ¡into ¡the ¡cells? ¡ What ¡are ¡some ¡of ¡the ¡characteris5cs ¡that ¡would ¡make ¡a ¡fluorophore ¡ ¡ useful ¡for ¡neural ¡imaging? ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ The ¡best ¡fluorophores ¡have ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ -­‑-­‑ ¡brightness ¡ ¡ dyes: ¡almost ¡always ¡have ¡ ¡ best ¡brightness ¡and ¡kine5cs ¡ -­‑-­‑ ¡high ¡signal-­‑to-­‑noise ¡ra5o, ¡ΔF/F ¡ ¡ ¡ ¡ -­‑-­‑ ¡large ¡change ¡in ¡fluorescence ¡upon ¡state ¡change ¡ ¡ ¡ ¡ -­‑-­‑ ¡fast ¡kine5cs ¡ ¡ ¡ ¡ -­‑-­‑ ¡low ¡toxicity ¡ ¡ ¡ gene5cally ¡encoded: ¡ -­‑-­‑ ¡long ¡dura5on ¡ introduced ¡with ¡a ¡transgene ¡ ¡ or ¡virus, ¡can ¡be ¡targeted ¡to ¡ par5cular ¡cell ¡types ¡ ¡ 3 ¡

2/28/13 ¡ The ¡big ¡problem ¡in ¡imaging: ¡signal-­‑to-­‑noise ¡ The ¡big ¡problem ¡in ¡imaging: ¡signal-­‑to-­‑noise ¡ ¡ ¡ Why ¡not ¡just ¡use ¡more ¡indicator, ¡drench ¡the ¡prep ¡in ¡more ¡light, ¡and ¡never ¡worry ¡about ¡ΔF/F? ¡ Why ¡not ¡just ¡use ¡more ¡indicator, ¡drench ¡the ¡prep ¡in ¡more ¡light, ¡and ¡never ¡worry ¡about ¡ΔF/F? ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ Problem ¡1: ¡phototoxicity– ¡light ¡kills ¡cells ¡ Problem ¡2: ¡excessive ¡light ¡bleaches ¡fluorophores ¡and ¡drama5cally ¡increases ¡phototoxicity ¡ Hockberger ¡et ¡al. ¡1999 ¡ invitrogen ¡ Voltage ¡sensors ¡ Outline: ¡ ¡ Light-­‑emikng ¡molecules ¡embedded ¡in ¡the ¡cell ¡membrane ¡that ¡signal ¡changes ¡in ¡ ¡ membrane ¡voltage. ¡ 1. History ¡and ¡principles ¡of ¡neuroimaging ¡ ¡ Dyes: ¡RH ¡414 ¡ 2. Review ¡three ¡different ¡types ¡of ¡imaging ¡ Gene5c: ¡FlaSh, ¡SPARC ¡ 1. Voltage-­‑sensi5ve ¡indicators ¡ ¡ From ¡Miller ¡et ¡al. ¡2012 ¡ ¡ 2. Calcium ¡indicators ¡ ¡ ¡ 3. Synap5c ¡release ¡indicators ¡ ¡ ¡ ¡ 3. Focus ¡on ¡one ¡imaging ¡project: ¡the ¡locomotor ¡CPG ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡From ¡Homma ¡et ¡al. ¡2009 ¡ 4 ¡

2/28/13 ¡ Calcium ¡sensors ¡ Synap5c ¡release ¡sensors ¡ ¡ ¡ Light-­‑emikng ¡molecules ¡floa5ng ¡in ¡the ¡cytosol ¡that ¡signal ¡changes ¡in ¡calcium ¡ Light-­‑emikng ¡molecules ¡inside ¡synap5c ¡vesicles ¡that ¡signal ¡release ¡of ¡ concentra5on. ¡ ¡Increased ¡calcium ¡ ¡is ¡a ¡strong ¡indicator ¡of ¡increased ¡cellular ¡ac5vity, ¡ neurotransmiYers ¡at ¡the ¡synapse. ¡ and ¡can ¡be ¡localized ¡to ¡a ¡single ¡synap5c ¡bouton. ¡ ¡ ¡ Dyes: ¡FM-­‑143, ¡AM4-­‑64 ¡ Dyes: ¡Fura, ¡Fluo, ¡Indo, ¡Calcium ¡Green ¡ Gene5c: ¡synaptopHluorins ¡ Gene5c: ¡cameleons, ¡G-­‑CaMP, ¡Troponin-­‑C ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ From ¡Griesbeck ¡lab ¡website, ¡Max ¡Planck ¡ From ¡Homma ¡et ¡al. ¡2009 ¡ From ¡Burrone ¡et ¡al. ¡2007 ¡ In ¡vivo ¡ imaging ¡ Outline: ¡ ¡ ¡ Imaging ¡techniques ¡can ¡be ¡used ¡to ¡monitor ¡neuronal ¡ac5vity ¡in ¡living ¡animals, ¡and ¡ even ¡in ¡awake ¡and ¡behaving ¡animals. ¡ ¡ 1. History ¡and ¡principles ¡of ¡neuroimaging ¡ 2. Review ¡three ¡different ¡types ¡of ¡imaging ¡ 1. Voltage-­‑sensi5ve ¡indicators ¡ 2. Calcium ¡indicators ¡ 3. Synap5c ¡release ¡indicators ¡ 3. Focus ¡on ¡one ¡imaging ¡project: ¡the ¡locomotor ¡CPG ¡ From ¡Kerr ¡and ¡Nimmerjahn ¡2012 ¡ 5 ¡