Joint use of AUC and SAS: advanced concepts Olwyn Byron - PowerPoint PPT Presentation

Joint ¡use ¡of ¡AUC ¡and ¡SAS: ¡advanced ¡concepts ¡ ¡ Olwyn ¡Byron ¡ ¡ School ¡of ¡Life ¡Sciences ¡ College ¡of ¡Medical, ¡Veterinary ¡and ¡Life ¡Sciences ¡ ¡ University ¡of ¡Glasgow, ¡Scotland ¡UK ¡ ¡

AUC ¡tutorials ¡ SeCng ¡up ¡and ¡running ¡AUC ¡experiments ¡ • Tutorial ¡paper ¡ • • Lebowitz, ¡J., ¡M.S. ¡Lewis, ¡and ¡P. ¡Schuck, ¡Modern ¡analyLcal ¡ultracentrifugaLon ¡in ¡protein ¡ science: ¡A ¡tutorial ¡review. ¡Protein ¡Science, ¡2002. ¡11(9): ¡p. ¡2067-­‑2079. ¡ AUC ¡user ¡guide ¡from ¡Demeler ¡lab ¡ • • hWp://www.uslims.uthscsa.edu/AUCuserGuideVolume-­‑1-­‑Hardware.pdf ¡ ¡ Data ¡analysis ¡ • Using ¡SEDFIT ¡& ¡SEDPHAT ¡ • • hWp://www.analyLcalultracentrifugaLon.com/default.htm ¡ Using ¡Ultrascan ¡ • • hWp://www.ultrascan.uthscsa.edu/ ¡

Wanna ¡buy ¡an ¡AUC? ¡ Choice ¡of ¡2 ¡instruments ¡ • Beckman ¡Coulter ¡ProteomeLab™ ¡XL-­‑A/XL-­‑I ¡(≈ ¡250k ¡Euro) ¡ • Spin ¡AnalyLcal ¡CFA ¡(available ¡early ¡2013) ¡(≈ ¡$200k) ¡ • • hWp://www.spinanalyLcal.com/cfa.php ¡

CFA: ¡Centrifugal ¡Fluid ¡Analyser ¡– ¡part ¡of ¡Open ¡AUC ¡Project ¡

CFA: ¡Centrifugal ¡Fluid ¡Analyser ¡ EnLrely ¡new ¡centrifuge ¡ • Capacity ¡for ¡3 ¡opLcal ¡systems ¡ • Detectors ¡outside ¡vacuum ¡system ¡ • Current ¡ • Dual ¡Wavelength ¡Fluorescence ¡(DWF); ¡permits: ¡ • • 2 ¡different ¡fluorescently ¡tagged ¡molecules ¡to ¡be ¡monitored ¡ simultaneously ¡ • FRET ¡detecLon ¡of ¡molecular ¡proximity ¡of ¡co-­‑sedimenters ¡ MulL-­‑wavelength ¡Absorbance ¡(MWA); ¡permits: ¡ • • separaLon ¡of ¡components ¡by ¡absorbance ¡spectrum ¡and ¡s ¡ Planned ¡ • Rayleigh ¡interference ¡ • Schlieren ¡refracLon ¡ • Small-­‑angle ¡light ¡scaWering ¡ • MulL-­‑angle ¡light ¡scaWering ¡ • (SAXS?) ¡ • ¡

Content ¡of ¡this ¡talk ¡ Detergent ¡solubilised ¡systems: ¡AUC, ¡SANS ¡ • Use ¡of ¡H 2 O/D 2 O ¡+ ¡AUC ¡to ¡determine ¡molecular ¡weight, ¡K d ¡etc ¡for ¡detergent ¡solubilised ¡ • proteins ¡ Use ¡of ¡SANS ¡to ¡determine ¡localisaLon ¡of ¡components ¡within ¡detergent ¡solubilised ¡proteins ¡ • Self-­‑ ¡and ¡hetero-­‑associaLons: ¡AUC, ¡SANS ¡ • DeterminaLon ¡of ¡stoichiometry ¡via ¡AUC: ¡SE ¡& ¡SV ¡LtraLon ¡experiments ¡ • DeterminaLon ¡of ¡stoichiometry ¡via ¡SANS: ¡LtraLon ¡with ¡deuterated ¡component ¡ •

Content ¡of ¡this ¡talk ¡ Detergent ¡solubilised ¡systems: ¡AUC, ¡SANS ¡ • Use ¡of ¡H 2 O/D 2 O ¡+ ¡AUC ¡to ¡determine ¡molecular ¡weight, ¡K d ¡etc ¡for ¡detergent ¡solubilised ¡ • proteins ¡ Use ¡of ¡SANS ¡to ¡determine ¡localisaLon ¡of ¡components ¡within ¡detergent ¡solubilised ¡proteins ¡ • Self-­‑ ¡and ¡hetero-­‑associaLons: ¡AUC, ¡SANS ¡ • DeterminaLon ¡of ¡stoichiometry ¡via ¡AUC: ¡SE ¡& ¡SV ¡LtraLon ¡experiments ¡ • DeterminaLon ¡of ¡stoichiometry ¡via ¡SANS: ¡LtraLon ¡with ¡deuterated ¡component ¡ •

Detergent ¡solubilised ¡proteins: ¡density ¡matching ¡SE ¡ ¡ In ¡SE ¡bouyant ¡molecular ¡weight ¡is ¡determined: ¡ • In ¡many ¡AUC ¡expts ¡we ¡want ¡to ¡observe ¡self-­‑associaLon ¡ • Density ¡matching ¡is ¡a ¡good ¡method ¡for ¡self-­‑associaLng ¡membrane ¡proteins ¡ • ¡ Burgess, ¡N. ¡K., ¡Stanley, ¡A. ¡M. ¡& ¡Fleming, ¡K. ¡G. ¡(2008). ¡DeterminaLon ¡of ¡Membrane ¡Protein ¡Molecular ¡Weights ¡and ¡AssociaLon ¡Equilibrium ¡ Constants ¡Using ¡SedimentaLon ¡Equilibrium ¡and ¡SedimentaLon ¡Velocity. ¡In ¡ Methods ¡in ¡Cell ¡Biology ¡(J. ¡Correia ¡& ¡H. ¡W ¡ ¡Detrich, ¡III, ¡eds.), ¡ 84 , ¡181-­‑211. ¡Academic ¡Press ¡ ¡

Density ¡matching ¡SE: ¡experimental ¡condiLons ¡ Experimental ¡condiLons ¡adjusted ¡such ¡that: ¡ • solvent ¡ ρ ¡= ¡effecLve ¡ ρ ¡of ¡bound ¡detergent ¡ • So ¡detergent ¡becomes ¡effecLvely ¡invisible ¡to ¡centrifugal ¡field ¡ • 0 ¡ SE ¡data ¡can ¡be ¡analysed ¡with ¡standard ¡methods ¡ ¡ •

BUT…..this ¡method ¡works ¡only ¡in ¡certain ¡condiLons ¡ The ¡solvent ¡density ¡must ¡be ¡adjusted ¡with ¡D 2 O ¡or ¡D 2 18 O ¡ • AlternaLves ¡would ¡be ¡e.g. ¡sucrose ¡or ¡other ¡co-­‑solvent ¡ • Affect ¡chemical ¡potenLal ¡ • Leads ¡to ¡preferenLal ¡binding ¡and/or ¡exclusion ¡of ¡water ¡or ¡the ¡addiLonal ¡co-­‑solvent ¡at ¡the ¡ • protein ¡surface ¡ But ¡use ¡of ¡D 2 O ¡or ¡D 2 18 O ¡limits ¡detergents ¡that ¡can ¡be ¡used ¡ • ρ ¡D 2 O ¡= ¡1.1 ¡g/ml ¡ • v ¡ ¡ ¡ ¡of ¡the ¡detergent ¡must ¡be ¡between ¡that ¡of ¡water ¡and ¡D 2 O ¡ • v i.e. ¡0.9 ¡≤ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡≤ ¡1.0 ¡ml/g ¡ • Eliminates: ¡ ¡ • v • dodecylmaltoside ¡( ρ ¡= ¡1.21 ¡g/ml, ¡ ¡ ¡ ¡= ¡0.83 ¡ml/g) ¡ • β -­‑octylglucoside ¡( ρ ¡= ¡1.15 ¡g/ml, ¡ ¡ ¡ ¡= ¡0.87 ¡ml/g) ¡ v Suitable: ¡ • • C 8 E 5 ¡( ¡ ¡ ¡ ¡= ¡0.993 ¡ml/g) ¡ v • C14SB ¡(density ¡matched ¡by ¡13% ¡D 2 O ¡in ¡20 ¡mM ¡Tris-­‑HCl, ¡200 ¡mM ¡KCl) ¡ • Dodecylphosphocholine ¡(DPC) ¡(density ¡matched ¡by ¡52.5% ¡D 2 O ¡in ¡50 ¡mM ¡Tris-­‑HCl, ¡100 ¡ mM ¡NaCl) ¡

¡DeterminaLon ¡of ¡density-­‑matching ¡point ¡for ¡C14SB ¡ Determine ¡% ¡of ¡D 2 O ¡required ¡to ¡density ¡match ¡C14SB ¡micelles ¡in ¡background ¡ • of ¡other ¡buffer ¡components ¡ 30 ¡mM ¡C14SB ¡in ¡20 ¡mM ¡Tris-­‑HCl, ¡200 ¡mM ¡KCl ¡made ¡in ¡0, ¡10, ¡20, ¡30% ¡D 2 O ¡ • Reference ¡solvent ¡the ¡same ¡minus ¡detergent ¡ • SE ¡observed ¡with ¡interference ¡opLcs ¡ • • Collect ¡“buffer ¡blanks” ¡for ¡subtracLon ¡to ¡reduce ¡noise ¡ • Then ¡replace ¡buffer ¡with ¡micelle ¡soluLon ¡in ¡sample ¡channel ¡ • Rotor ¡speed ¡50k ¡rpm ¡ • T ¡= ¡25°C ¡ ¡ ¡ slope ¡of ¡distribuLon ¡ fringes ¡ 0 ¡ ρ micelle ¡> ¡ ρ solvent ¡ ρ micelle ¡= ¡ ρ solvent ¡ ρ micelle ¡< ¡ ρ solvent ¡ 0 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡10 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡20 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡30 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ radius ¡ % ¡D 2 O ¡

SE ¡of ¡systems ¡solublised ¡by ¡C14SB: ¡OMPLA ¡ Outer ¡membrane ¡phospholipase ¡A ¡(OMPLA) ¡ • Beckman ¡XL-­‑A, ¡T ¡= ¡25°C ¡ • 20 ¡mM ¡Tris-­‑HCl, ¡200 ¡mM ¡KCl ¡ ¡ • 13% ¡D 2 O ¡ • [OMPLA] ¡= ¡0.3, ¡0.6. ¡0.9 ¡A 280 ¡(12 ¡mm ¡pathlength) ¡ • Rotor ¡speed ¡= ¡16.3, ¡20, ¡24.5 ¡k ¡rpm ¡ • [C14SB] ¡= ¡5 ¡mM ¡ • Increased ¡[detergent] ¡results ¡in ¡diluLon ¡of ¡protein ¡that ¡is ¡solublised ¡in ¡ • detergent ¡phase ¡thus ¡promoLng ¡dissociaLon ¡ Monomer ¡mass ¡determined ¡ •

SE ¡of ¡systems ¡solublised ¡by ¡C14SB: ¡OmpF ¡ E. ¡coli ¡OmpF ¡ • Beckman ¡XL-­‑A, ¡T ¡= ¡25°C ¡ • 20 ¡mM ¡Tris-­‑HCl, ¡100 ¡or ¡200 ¡mM ¡KCl ¡ ¡ • 13% ¡D 2 O ¡ • OmpF ¡normally ¡trimer ¡ • Collected ¡36 ¡data ¡sets: ¡ • [OmpF] ¡= ¡0.3, ¡0.6. ¡0.9 ¡A 230 ¡(12 ¡mm ¡pathlength) ¡ • [C14SB] ¡= ¡5, ¡12 ¡& ¡30 ¡mM ¡ • Rotor ¡speed ¡= ¡9, ¡11, ¡13.5, ¡16.3 ¡k ¡rpm ¡ •

Which ¡speed? ¡ Chervenka, ¡C. ¡H. ¡ A ¡Manual ¡of ¡Methods ¡for ¡the ¡Analy8cal ¡Ultracentrifuge . ¡ Spinco ¡Division, ¡Beckman ¡Instruments, ¡Palo ¡Alto, ¡1969. ¡