Greensboro-Aus+n iGEM Team Gene+c code Non-canonical amino - PowerPoint PPT Presentation

Greensboro-­‑Aus+n ¡iGEM ¡Team ¡

Gene+c ¡code ¡ Non-­‑canonical ¡amino ¡acids ¡ Mussel ¡adhesion ¡proteins ¡ BactoArt ¡ Biosecurity ¡ Open ¡Sequence ¡Ini+a+ve ¡ 2 ¡

The ¡gene+c ¡code ¡ ¡ 3 ¡

Transla'on ¡ Charged ¡tRNA ¡ AMP ¡+ ¡PPi ¡ tRNA ¡& ¡ ¡ Synthetase ¡pair ¡ Polypep+de ¡ Ribosome ¡& ¡tRNA ¡

What ¡could ¡we ¡do ¡with ¡an ¡ expanded ¡gene+c ¡code? ¡ 5 ¡

Can ¡your ¡gene+c ¡code ¡do ¡ this ? ¡ heavy ¡atom ¡for ¡X-­‑ray ¡ covalent ¡bonds ¡via ¡ crystallography ¡ photocrosslinking ¡ extended ¡disulfide ¡bridges ¡ fluorescent ¡ (long ¡distance ¡staples!) ¡ amino ¡acid ¡ 6 ¡

So ¡how ¡exactly ¡do ¡we ¡code ¡for ¡a ¡21 st ¡ amino ¡acid? ¡ 7 ¡

Redundancy ¡in ¡the ¡gene+c ¡code ¡ ¡

Gene+c ¡code ¡ Non-­‑canonical ¡amino ¡acids ¡ Mussel ¡adhesion ¡proteins ¡ BactoArt ¡ Biosecurity ¡ Open ¡Sequence ¡Ini+a+ve ¡ 9 ¡

Methanocaldococcus ¡jannaschii ¡ ¡ Tyrosine ¡ A ¡U ¡C ¡ Deiters ¡A, ¡and ¡Schultz ¡PG. ¡In ¡vivo ¡incorpora+on ¡of ¡an ¡alkyne ¡into ¡proteins ¡in ¡Escherichia ¡coli. ¡Bioorg ¡Med ¡Chem ¡LeZ. ¡2005 ¡Mar ¡1;15(5): 10 ¡ 1521-­‑4.Pubmed ¡PMID: ¡15713420 . ¡

M. ¡jannaschii ¡ tyrosyl-­‑tRNA ¡synthetase ¡ ncAA ¡ A ¡U ¡C ¡ 11 ¡

Non-­‑canonical ¡Transla+on ¡ ncAA ¡ ncAA ¡ Charged ¡tRNA ¡ AMP ¡+ ¡PPi ¡ AUC ¡ AUC ¡ tRNA ¡& ¡Synthetase ¡pair ¡ ncAA ¡ AUC ¡ Polypep+de ¡ UAG ¡ Ribosome ¡& ¡tRNA ¡ ncAA ¡ 12 ¡

Tes+ng ¡synthetase ¡incorpora+on ¡with ¡ GFP ¡ Normal ¡GFP ¡Fluorophore ¡ GFP ¡Fluorophore ¡with ¡ncAA ¡3-­‑iodotyrosine ¡ 13 ¡

Tes+ng ¡synthetase ¡incorpora+on ¡ Tyrosine ¡ 14 ¡

Tes+ng ¡synthetase ¡incorpora+on ¡ 15 ¡

Tes+ng ¡synthetase ¡incorpora+on ¡ Tyrosine ¡ 16 ¡

Tes+ng ¡synthetase ¡incorpora+on ¡ 3-­‑Iodotyrosine ¡ 17 ¡

Tes+ng ¡synthetase ¡incorpora+on ¡ 3-­‑Iodotyrosine ¡ 18 ¡

Bringing ¡ncAA ¡to ¡iGEM ¡ • BBa_K1178000 ¡ – tRNA ¡and ¡synthetase ¡to ¡repurpose ¡UAG ¡codon ¡for ¡ ncAA ¡usage ¡ Muta'ons ¡necessary ¡for: ¡ 3-­‑iodotyrosine ¡incorpora+on ¡ L-­‑DOPA ¡incorpora+on ¡ ¡ H-­‑70 ¡to ¡A ¡ Y-­‑32 ¡to ¡L ¡ D-­‑158 ¡to ¡T ¡ A-­‑67 ¡to ¡S ¡ I-­‑ ¡159 ¡to ¡S ¡ H-­‑70 ¡to ¡N ¡ A-­‑167 ¡to ¡Q ¡ 19 ¡ Sakamoto ¡et. ¡al. ¡ ¡ Alfonta ¡et. ¡al ¡

Other ¡Possibili+es ¡ p -­‑Acetylphenylalanine ¡ p -­‑Benzoylphenylalanine ¡ O -­‑methyltyrosine ¡ Liu ¡CC, ¡Schultz ¡PG. ¡Adding ¡New ¡Chemistries ¡to ¡the ¡Gene+c ¡Code. ¡Annu ¡Rev ¡Biochem. ¡2010;79:413-­‑44. ¡doi: ¡10.1146/annurev.biochem. 20 ¡ 052308.105824. ¡PubMed ¡PMID: ¡20307192. ¡

Gene+c ¡code ¡ Non-­‑canonical ¡amino ¡acids ¡ Mussel ¡adhesion ¡proteins ¡ BactoArt ¡ Biosecurity ¡ Open ¡Sequence ¡Ini+a+ve ¡ 21 ¡

Improving ¡an ¡ncAA-­‑dependent ¡phenotype ¡ ncAA ¡ (phenotype) ¡ 1. ¡Find: ¡ protein ¡X ¡ ncAA ¡ ncAA ¡ 2. ¡Test: ¡ ↑ ¡phenotype ¡

Improving ¡an ¡ncAA-­‑dependent ¡phenotype ¡ ncAA ¡ protein ¡X ¡ ncAA ¡ ncAA ¡

The ¡mussel’s ¡glue ¡ • strong ¡and ¡durable ¡ • s+ck ¡to ¡variety ¡of ¡surfaces ¡ • surgical ¡sutures ¡ • works ¡underwater ¡ • underwater ¡adhesives ¡ • non-­‑immunogenic ¡ • environmentally-­‑friendly ¡

The ¡mussel’s ¡glue ¡ adhesive ¡ proper+es ¡ L-­‑tyrosine ¡ L-­‑DOPA ¡ (non-­‑canonical) ¡

Probing ¡the ¡limits ¡of ¡adhesiveness ¡ adhesiveness ¡ ¡ ∝ ¡ ¡ L-­‑DOPA ¡ content ¡ but: ¡indeterminate ¡fate ¡of ¡tyrosines ¡ Y ¡ Y ¡ glue ¡ glue ¡ protein ¡ protein ¡ Y ¡ Y ¡ Y ¡ L-­‑DOPA ¡ with ¡codon ¡repurposing: ¡ fine-­‑tuned ¡control ¡& ¡predictability ¡ MAP01 ¡ MAP02 ¡ MAP17 ¡ … ¡

Library ¡construc+on ¡ 13 ¡gBlocks: ¡ 5’ ¡ fp1 : ¡ ¡ ¡0 ¡– ¡10 ¡Ambers ¡ 3’ ¡ fp1 : ¡ ¡ ¡0 ¡– ¡11 ¡Ambers ¡ fp5 : ¡ ¡ ¡0 ¡– ¡20 ¡Ambers ¡ Challenges: ¡ • highly ¡repe++ve ¡sequences ¡ • G/C ¡content ¡

Library ¡construc+on ¡ Amber ¡codons ¡in ¡ fp5 : ¡ Amber ¡codons ¡in ¡ fp1 : ¡ 5’ ¡ fp1 ¡ fp5 ¡ 3’ ¡ fp1 ¡ # ¡Ambers ¡ 5’ ¡ fp1 ¡ fp5 ¡ 3’ ¡ fp1 ¡ # ¡Ambers ¡ 0 ¡ 0 ¡ 0 ¡ 0 ¡ 2 ¡ 0 ¡ 0 ¡ 2 ¡ 0 ¡ 4 ¡ 0 ¡ 4 ¡ 2 ¡ 0 ¡ 5 ¡ 7 ¡ 0 ¡ 7 ¡ 0 ¡ 7 ¡ 5 ¡ 0 ¡ 5 ¡ 10 ¡ 0 ¡ 10 ¡ 0 ¡ 10 ¡ 5 ¡ 0 ¡ 9 ¡ 14 ¡ 0 ¡ 20 ¡ 0 ¡ 20 ¡ 10 ¡ 0 ¡ 9 ¡ 19 ¡ Mixed ¡variants: ¡ 5’ ¡ fp1 ¡ fp5 ¡ 3’ ¡ fp1 ¡ # ¡Ambers ¡ 2 ¡ 4 ¡ 2 ¡ 8 ¡ 2 ¡ 7 ¡ 2 ¡ 11 ¡ 5 ¡ 4 ¡ 5 ¡ 14 ¡ 5 ¡ 7 ¡ 5 ¡ 17 ¡ 5 ¡ 10 ¡ 5 ¡ 20 ¡ 5 ¡ 20 ¡ 5 ¡ 30 ¡ 10 ¡ 20 ¡ 9 ¡ 39 ¡

Future ¡direc'on: ¡self-­‑sufficiency ¡ TH ¡ tRNA L-­‑DOPA ¡ L-­‑DOPA ¡RS ¡ L-­‑DOPA ¡ ¡( ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡) ¡ L-­‑tyrosine ¡ L-­‑DOPA-­‑tRNA L-­‑DOPA ¡ AUC ¡ UAG ¡ ribosome ¡

glue ¡protein ¡variant ¡ PCD ¡ TH ¡ DHPR ¡ L-­‑DOPA ¡ ¡( ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡) ¡ L-­‑DOPA ¡RS ¡ tRNA ¡ L-­‑DOPA-­‑tRNA L-­‑DOPA ¡

glue ¡protein ¡variant ¡ PCD ¡ TH ¡ DHPR ¡ • 5 ¡different ¡ organisms ¡ L-­‑DOPA ¡RS ¡ tRNA ¡ • all ¡three ¡domains ¡ of ¡life! ¡

Gene+c ¡code ¡ Non-­‑canonical ¡amino ¡acids ¡ Mussel ¡adhesion ¡proteins ¡ BactoArt ¡ Biosecurity ¡ Open ¡Sequence ¡Ini+a+ve ¡ 32 ¡

Gene+c ¡code ¡ Non-­‑canonical ¡amino ¡acids ¡ Mussel ¡adhesion ¡proteins ¡ BactoArt ¡ Biosecurity ¡ Open ¡Sequence ¡Ini+a+ve ¡ 40 ¡

Biosecurity ¡

Biosecurity ¡– ¡Pathogenic ¡Gene ¡Synthesis ¡ • No ¡regula+on ¡ requiring ¡ DNA ¡synthesis ¡companies ¡ to ¡screen ¡orders ¡ ¡ • 80% ¡of ¡companies ¡screen ¡ dsDNA ¡orders ¡down ¡to ¡ 200 ¡bp ¡against ¡a ¡select ¡ agent ¡list ¡of ¡pathogenic ¡ sequences ¡ 42 ¡

Biosecurity ¡– ¡Pathogenic ¡Gene ¡Synthesis ¡ • No ¡regula+on ¡ requiring ¡ DNA ¡synthesis ¡companies ¡ to ¡screen ¡orders ¡ ¡ • 80% ¡of ¡companies ¡screen ¡ dsDNA ¡orders ¡down ¡to ¡ 200 ¡bp ¡against ¡a ¡select ¡ agent ¡list ¡of ¡pathogenic ¡ sequences ¡ • ssDNA? ¡ 43 ¡

DNA ¡Synthesis ¡and ¡Select ¡Agents ¡ • From ¡discussions ¡with ¡FBI ¡ agents ¡we’ve ¡learned ¡that ¡ oligo ¡orders ¡aren’t ¡screened ¡ at ¡all ¡ • Gene ¡synthesis ¡using ¡single-­‑ stranded ¡oligos ¡is ¡doable ¡by ¡ any ¡moderately ¡trained ¡ synthe+c ¡biologist ¡ acg+nc.com ¡ 44 ¡

Oligo ¡Screening ¡Program ¡ Chop ¡framed ¡ Use ¡Best ¡ Read ¡oligo ¡at ¡6 ¡ Run ¡chopped ¡ sequences ¡ Match ¡to ¡ reading ¡ sequences ¡ into ¡certain ¡ determine ¡Top ¡ frames ¡ through ¡BLAST ¡ lengths ¡( L ) ¡ Hit ¡ If ¡homologous, ¡ set ¡pathogen ¡ to ¡“YES” ¡ Chop ¡famed ¡ Query ¡ Use ¡Best ¡Match ¡ Set ¡6 ¡reading ¡ sequences ¡into ¡ Nucleo+de ¡ to ¡determine ¡ frames ¡ certain ¡lengths ¡ ¡ Database ¡ ¡ Top ¡Hit ¡ If ¡no ¡homology, ¡ set ¡pathogen ¡ to ¡“NO” ¡ 45 ¡

FBI ¡Biosecurity ¡Workshop ¡at ¡UT ¡ 46 ¡

FBI ¡Biosecurity ¡Workshop ¡at ¡UT ¡ We’d ¡like ¡to ¡thank ¡Agents ¡You, ¡So ¡ and ¡Runkel ¡ 47 ¡

Gene+c ¡code ¡ Non-­‑canonical ¡amino ¡acids ¡ Mussel ¡adhesion ¡proteins ¡ BactoArt ¡ Biosecurity ¡ Open ¡Sequence ¡Ini+a+ve ¡ 48 ¡