UT ¡iGEM ¡2012: ¡Caffeinated ¡coli ¡ h7p://2012.igem.org/Team:AusAn_Texas ¡
Caffeine P. putida CBB5 Addiction Refactored operon Measurement Inducible promoter
Caffeine • Caffeine ¡is ¡1,3,7-‑trimethyl xanthine ¡ • Xanthine ¡is ¡a ¡guanine ¡precursor ¡ Caffeine • Annual ¡producAon: ¡120,000 ¡tons ¡ ¡ Xanthine
Environmental Impact • Most ¡organisms ¡cannot ¡efficiently ¡ degrade ¡caffeine ¡ • Significant ¡accumulaAon ¡in ¡the ¡ environment ¡from ¡industrial ¡and ¡ waste ¡water ¡sources ¡ • Caffeine ¡levels ¡are ¡used ¡to ¡measure ¡ human ¡impact ¡on ¡bodies ¡of ¡water ¡ • As ¡high ¡as ¡70ug/L ¡measured ¡in ¡water ¡ http://www.geog.ucsb.edu around ¡populated ¡areas ¡(Switzerland)* ¡ *Buerge ¡et ¡al. ¡(2003) ¡Caffeine, ¡an ¡Anthropogenic ¡Marker ¡for ¡Wastewater ¡ ContaminaAon ¡of ¡Surface ¡Waters, ¡Environ. ¡Sci. ¡Technol. ¡2003, ¡37, ¡691-‑700
And who is to blame? Source: The Huffington Post (originally from http://www.ilovecoffee.jp)
Decaffeination • Clean ¡up ¡the ¡environmental ¡ impacts ¡of ¡caffeine ¡polluAon ¡ • Detoxify ¡caffeinated ¡industrial ¡ waste ¡for ¡use ¡as ¡feed ¡stock ¡ • Produce ¡precursors ¡for ¡ h7ps://www.avma.org/News/PressRoom/Cows/k7964-‑1.jpg ¡ methylxanthine-‑based ¡drugs ¡ Trental-‑ ¡an ¡arterial ¡dilator ¡from ¡theobromine ¡ h7p://www.sfms.org/Portals/3/assets/images/Blog/Pills.jpg ¡
PolluAon ¡Drives ¡EvoluAon? ¡ • Nylon ¡first ¡produced ¡in ¡ ¡ 1935 ¡ • Nylon-‑eaAng ¡ Flavobacterium ¡ found ¡in ¡ wastewater ¡of ¡nylon ¡ producAon ¡factory ¡in ¡1975 ¡ ¡ ¡ ¡ • Are ¡there ¡bacteria ¡ capable ¡of ¡degrading ¡ ¡ caffeine? ¡ ¡
Caffeine P. putida CBB5 Addiction Refactored operon Measurement Inducible promoter
Pseudomonas ¡pu4da ¡ CBB5 ¡ • Discovered ¡by ¡Ryan ¡Summers ¡and ¡Mani ¡ Subramanian ¡at ¡the ¡University ¡of ¡Iowa ¡ ¡ • Can ¡live ¡on ¡caffeine ¡as ¡the ¡sole ¡carbon ¡and ¡ nitrogen ¡source ¡ Summers RM et al. (2012) J. Bact. 194 :2041-2049.
CBB5 ¡Caffeine ¡DemethylaAon ¡Pathway ¡ • CBB5 ¡metabolizes ¡caffeine ¡and ¡other ¡methylxanthines ¡to ¡ xanthine ¡using ¡an ¡ N -‑demethylaAon ¡pathway ¡ orf4 ¡ ndmB ¡ orf5 ¡ orf1 ¡ orf2 ¡ ndmA ¡ orf3 ¡ orf6 ¡ ndmC ¡ ndmD ¡ orf8 ¡
Caffeine P. putida CBB5 Addiction Refactored operon Measurement Inducible promoter
“Addicting” E.coli to Caffeine PRPP ¡ Caffeine IMP inosine-5'-phosphate GuaB CBB5 operon (IMP Dehydrogenase) gpt XMP Xanthine Xanthosine-5’-Phosphate (Xanthine salvage pathway) DNA and RNA dGTP
Cloning ¡naAve ¡CBB5 ¡demethylaAon ¡operon ¡ orf1 ¡ orf2 ¡ ndmA ¡ orf3 ¡ orf4 ¡ ndmB ¡ orf5 ¡ orf6 ¡ ndmC ¡ ndmD ¡ orf8 ¡ EcoRI - 13.2 kb known sequence XbaI - Cloned into pACYC184 plasmid EcoRI - Transformed into guaB knockout Reg1 PstI chlR fdh XbaI No growth PstI 14000 2000 NdmA Operon_pACYC184 4000 NdmD 12000 15815 bps Possible incompatibilities: XbaI Mem 10000 PstI 6000 NdmC 8000 Reg2 P. putida CBB5 optimizing for E. coli ORF-5 NdmB trans non-optimal RBSs experimentally proven RBSs EcoRI EcoRI EcoRI non-optimal promoters experimentally proven promoters Will refactoring restore GTG start codons ATG start codons functionality? uncharacterized regulators constitutive expression
Caffeine P. putida CBB5 Addiction Refactored operon Measurement Inducible promoter
Refactored ¡demethylaAon ¡operon ¡ Promoter: ¡(BBa_J23100) ¡ RBS: ¡(BBa_B0034) ¡ ¡ AAAGAGGAGAAA ¡ ¡ ndmABCD ¡ ¡ refactored ¡from ¡ ¡ P. ¡pu4da ¡ CBB5, ¡including ¡ ATG ¡replacements ¡ gst9 : ¡ ¡ Janthinobacterium ¡Marseille ¡ orf1 ¡ orf2 ¡ ndmA ¡ orf3 ¡ orf4 ¡ ndmB ¡ orf5 ¡ orf6 ¡ ndmC ¡ ndmD ¡ orf8 ¡
Assembly: ¡One-‑step, ¡6-‑piece ¡Gibson ¡assembly ¡ = ¡RBS ¡(from ¡BBa_B0034) ¡+ ¡ATG ¡ promoter ¡ ndmA ¡ ndmB ¡ ndmC ¡ ndmD ¡ gst9 ¡ pSB1C3 ¡ Gibson isothermal assembly ndmA ¡ ndmC ¡ ndmD ¡ gst9 ¡ BBa_23100 ¡ ndmB ¡ promoter ¡ pSB1C3 ¡ BBa_K734000
BioBroken? ndmA ¡ ndmB ¡ ndmC ¡ ndmD ¡ gst9 ¡ BBa_23100 ¡ promoter ¡ pSB1C3 ¡ Is it time for a new standard?
Caffeine P. putida CBB5 Addiction Refactored operon Measurement Inducible promoter
Growth of guaB knockout with and without decaffeination operon 0.5 0.45 0.4 0.35 - Operon + 0uM Supplement 0.3 OD595 + Operon + 0uM Supplement 0.25 - Operon + 100uM Xanthine + Operon + 100uM Xanthine 0.2 - Operon + 100uM Caffeine 0.15 + Operon + 100uM Caffeine 0.1 0.05 0 0 5 10 Hours 15 20 25
Growth in caffeinated beverages – + decaffeination operon – + decaffeination operon
Growth in caffeinated beverages – + decaffeination operon – + decaffeination operon
Growth in caffeinated beverages – + decaffeination operon
• Growth of guaB knockout E.coli with decaffeination operon shows linear dependence on caffeine concentration. • Calculated that 7.6 +/- 0.8pg of caffeine was used per cell
Molecular ¡AccounAng ¡ • Calculated that 7.6 +/- 0.8 pg of caffeine was used per cell Mole lecule les p per cell ll Guanine required 2.55 × 10 10 (theoretical) Caffeine consumed 2.40 × 10 10 (measured)
Caffeine Content Calculations OD 600 = 0.0142*(uM Caffeine) + 0.1058 Beverage ¡ Measured Caffeine Reported Caffeine Content (mg/L) ¡ Content (mg/L) ¡ Coke ¡ 105 ± 6 ¡ 99 ¡ Diet Coke ¡ 133 ± 10 ¡ 130 ¡ Monster ¡ 374 ± 31 ¡ 338 ¡ Red Bull ¡ 263 ± 15 ¡ 322 ¡ Errors ( ± ) are standard deviations
Caffeine P. putida CBB5 Addiction Refactored operon Measurement Inducible promoter
TranscripAonal ¡Regulators ¡& ¡Promoters ¡ • SyntheAc ¡biology ¡needs ¡more ¡ inducible ¡promoters! ¡ • IPTG ¡is ¡expensive ¡(>$10.00/g) ¡ • DegradaAon ¡operon ¡is ¡likely ¡ regulated ¡by ¡methylxanthines ¡ in ¡ Pseudomonas ¡pu4d a ¡CBB5. ¡ ¡ • Caffeine ¡is ¡cheap ¡($0.30/g) ¡ Collins ¡et ¡al. ¡SyntheAc ¡gene ¡ networks ¡that ¡count. ¡Science, ¡2009 ¡ ¡
TranscripAonal ¡Regulators ¡& ¡Promoters ¡ P. ¡pu4da ¡ naAve ¡caffeine ¡degradaAon ¡operon ¡ orf4 ¡ ndmB ¡ orf1 ¡ orf2 ¡ ndmA ¡ orf3 ¡ orf5 ¡ orf6 ¡ ndmC ¡ ndmD ¡ orf8 ¡ LacZ ¡ orf1 ¡ orf4 ¡ Or • Two ¡putaAve ¡transcripAonal ¡regulators ¡ • Intergenic ¡regions ¡may ¡contain ¡regulated ¡promoters ¡
Protein ¡Based ¡Repression ¡of ¡ ndmA ¡Promoter ¡ HELP! HELP! I’m Being Repressed! • Confirms ¡presence ¡of ¡ ndmA ¡promoter ¡ • orf4 ¡protein ¡regulates ¡ ndmA ¡ expression ¡ *credit Monty Python and the Holy Grail, Michael White Productions
Caffeine-based Induction of ndmA Promoter
Summary of Results • Refactored decaffeination operon from P. putida CBB5 into E. coli. • “Addicted" E. coli to caffeine. • Used the addicted cells to accurately measure caffeine content of common beverages. • Characterized a methylxanthine- responsive transcriptional regulator.
UT Austin iGEM 2012 Undergraduates Ben Slater Peter Outopal Razan Alnahhas Logan Bachman Aurko Dasgupta Will Darden Advisors Prof. Jeff Barrick Michael Hammerling Erik Quandt Jared Ellefson
Looking face down on a coffee cup Questions?
Questions? • Refactored decaffeination operon from P. putida CBB5 into E. coli. • “Addicted" E. coli to caffeine. • Used the addicted cells to accurately measure caffeine content of common beverages. • Characterized a methylxanthine- responsive transcriptional regulator.
RFC512 : A universal standard for fast, seamless part assembly 1. Parts amplified by PCR 2. Assembled via overlapping homologies (Gibson, OLE, MEGAWHOP, etc) 3. New standard vector with new prefix and suffix for quality control 4. Homing endonuclease sites I-SceI and I-CeuI I-CeuI I-SceI Advantages: • Reduces likelihood of presence of incompatible restriction sites in natural and engineered parts to negligible levels • Compatible with both restriction and Gibson assembly methods • Both homing endonucleases have ≥ 50% activity in NEBuffer 4, supporting quality control via restriction enzyme cleavage
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