Activation-inactivation intercellular signaling in one- and - PowerPoint PPT Presentation

Activation-inactivation intercellular signaling in one- and two-dimensions Faisal Naqib and Horia Vulpe representing the McGill 2009 iGEM Team.

• Description of signaling network • Mathematical modeling • Engineered biological signaling network • Wetlab experiments

Why explore signaling? Using synthetic biology to learn about natural biology. Many applications depend on cell signaling. Microbiological based sensors are a form of cell signaling.

Signaling Network

Signaling Network Two diffusible proteins: one activating and one inhibiting. Separation distance was primary interest. Three types of dynamics possible: • Steady state • Oscillations • No interaction

Mathematical Modeling

Model Equations Par$al ¡differen$al ¡equa$on ¡(PDE) ¡based ¡model, ¡which ¡was ¡an ¡ expansion ¡of ¡a ¡model ¡ini$ally ¡presented ¡by ¡Shymko ¡and ¡Glass ¡ (1974). Ψ1 ¡and ¡Ψ2 ¡represent ¡the ¡concentra$ons ¡of ¡the ¡ ac$va$ng ¡and ¡inhibi$ng ¡molecules, ¡ respec$vely, ¡γi ¡the ¡degrada$on ¡constant, ¡Di ¡ the ¡diffusion ¡constant, ¡λi ¡the ¡maximal ¡synthesis ¡ rate ¡of ¡molecule ¡i, ¡and ¡δ ¡the ¡Dirac ¡func$on. ¡fi ¡ represents ¡the ¡Hill ¡func$on ¡describing ¡the ¡ dependence ¡on ¡the ¡opposing ¡molecule. ¡where ¡ n, ¡b, ¡and ¡θ ¡are ¡posi$ve. ¡

1D Simulations Equa$ons ¡solved ¡numerically ¡using ¡a ¡forward ¡Euler ¡scheme ¡in ¡ $me ¡and ¡a ¡centered ¡difference ¡scheme ¡in ¡space. ¡Cyclical ¡ boundary ¡condi$ons ¡were ¡assumed; ¡meaning ¡the ¡spa$al ¡ dimension ¡formed ¡a ¡ring.

The ¡red ¡bar ¡represents ¡the ¡inhibi-­‑ ¡tory ¡site, ¡ which ¡remains ¡fixed ¡in ¡posi$on ¡while ¡the ¡ ac$va$ng ¡site, ¡blue ¡bar, ¡is ¡sequen$ally ¡moved ¡ around ¡the ¡ring.

Frequency vs. Separation Distance -1 frequency corresponds to complex oscillations that frequency could not be easily computed.

Classifying Oscillations The ¡leU ¡map ¡has ¡a ¡finite ¡number ¡of ¡points, ¡meaning ¡that ¡it ¡is ¡ periodic, ¡while ¡the ¡right ¡map ¡is ¡forming ¡a ¡closed ¡curve, ¡ indica$ve ¡of ¡quasiperiodicity.

Phase Lag • At close separation distances oscillations in sync. • Quasiperiodicity. • Intermediate distances at 180 degrees out of sync. • Large enough distances results in possibly no interaction. The perfect reflection across the line y=x of the phase plane curve means the two oscillations are always 180 degrees out of phase. This type of oscillations was present for a wide range of separation distances.

Effect of other parameters Degrada$on ¡constant ¡changing ¡in ¡$me. ¡ Oscilla$ons ¡appear ¡as ¡ degrada$on ¡constant ¡ 0.1 ¡ 3 ¡ is ¡increased ¡ Diffusion ¡constant ¡changing ¡in ¡$me. ¡ Amplitude ¡of ¡ 0.1 ¡ 3 ¡ oscilla$ons ¡decreases ¡ as ¡diffusion ¡constant ¡ increases. ¡

2D Simulations We also looked at the different dynamics resulting from different geometries in two dimensions. Here we have leaking boundary conditions and 5 lines of activating cells and 4 lines of inhibitory cells.

2D Simulations We also looked at the different dynamics resulting from different geometries in two dimensions. Here we have leaking boundary conditions and 5 lines of activating cells and 4 lines of inhibitory cells.

2D Simulations Cyclical boundary conditions with alternating lines of activating and inhibiting cells.

2D Simulations Cyclical boundary conditions with alternating lines of activating and inhibiting cells.

2D Simulations Cyclical boundary conditions with alternating lines of activating and inhibiting cells in both latitude and longitude.

2D Simulations Cyclical boundary conditions with alternating lines of activating and inhibiting cells in both latitude and longitude.

System ¡Design ¡

Outline ¡ 1. Transcrip$on ¡factors ¡ 2. Promoters ¡ 3. Reporters ¡ 4. The ¡system ¡

Transcrip4on ¡Factors ¡ 1. Freely ¡diffusible ¡across ¡the ¡membrane ¡ 2. Turn ¡their ¡respec$ve ¡promoter ¡ON ¡and ¡ OFF ¡ 3. Do ¡not ¡interact ¡with ¡each ¡other’s ¡ promoters ¡

Transcrip4on ¡Factors ¡ • 3OC 6 -­‑HSL ¡ ¡ Acts ¡on ¡its ¡promoter ¡in ¡associa$on ¡with ¡LuxR ¡ • Is ¡produced ¡by ¡the ¡synthetase ¡LuxI ¡(LVA ¡tagged) ¡ • Lux ¡I ¡ (3OC 6 -­‑HSL) ¡ + LuxR ¡

Transcrip4on ¡Factors ¡ • C 4 -­‑HSL ¡ ¡ Acts ¡on ¡its ¡promoter ¡in ¡associa$on ¡with ¡RhlR ¡ • Is ¡produced ¡by ¡the ¡synthetase ¡RhlI ¡(LVA ¡tagged) ¡ • Rhl ¡I ¡ (C 4 -­‑HSL) ¡ + RhlR ¡

Promoters ¡ 1. Lux ¡pL ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ “ON ¡promoter”. ¡Turned ¡OFF ¡by ¡LuxR/3OC 6 HSL. ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ + LuxR ¡ (3OC 6 -­‑HSL) ¡ 2. ¡ ¡RhlR ¡+ ¡C4 ¡ ¡ ¡ ¡ “OFF ¡promoter”. ¡Turned ¡ON ¡by ¡RhlR/C 4 -­‑HSL. ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ + RhlR ¡ (C 4 -­‑HSL) ¡

(3OC 6 -­‑HSL) ¡ (C 4 -­‑HSL) ¡

Transcrip4on ¡Factors ¡ No ¡Cross-­‑talk ¡between ¡HSLs ¡ ¡ 1. “ Wild-­‑type ¡ LuxR ¡exhibits ¡no ¡response ¡to ¡ butanoyl-­‑HSL ¡(C4HSL)” ¡ Source: ¡ ¡ -­‑Directed ¡Evolu$on ¡of ¡Vibrio ¡fischeri ¡LuxR ¡for ¡Improved ¡Response ¡to ¡Butanoyl-­‑Homoserine ¡Lactone. ¡ ¡ Andrew ¡C. ¡Hawkins, ¡Frances ¡H. ¡Arnold, ¡Rainer ¡Stuermer,Bernhard ¡Hauer, ¡and ¡Jared ¡R. ¡Leadbejer1*, ¡ 2007, ¡APPLIED ¡AND ¡ENVIRONMENTAL ¡MICROBIOLOGY, ¡p. ¡5775–5781. ¡ ¡ LuxR ¡ + ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ (C 4 -­‑HSL) ¡

Transcrip4on ¡Factors ¡ No ¡Cross-­‑talk ¡between ¡HSLs ¡ ¡ 2. ¡iGEM: ¡Part:BBa_F2620:Specificity ¡page ¡ ¡ ¡ Transfer ¡func$on ¡( ¡for ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡promoter) ¡

Reporters ¡ 1. EYFP ¡– ¡AAV ¡ ¡ ¡ ¡2. ¡ECFP ¡-­‑ ¡AAV ¡ Emission ¡spectra ¡ Source: ¡Princeton ¡Instruments. ¡ ¡ hjp://www.princetoninstruments.com/Uploads/Princeton/Documents/Library/UpdatedLibrary/ Dual_labeling_using_green_fluorescent_proteins.pdf ¡

Constructs ¡ 1. Construct ¡1 ¡“Inhibitor” ¡ 2. Construct ¡2 ¡“Ac$vator” ¡ Cons$tu$ve ¡ ¡Bicistronic ¡construct. ¡ RhlI/EYFP ¡ ¡Transcribed ¡in ¡tandem ¡

Gene ¡Synthesis ¡and ¡Experiments ¡ ¡ 1. Synthesis ¡of ¡constructs ¡ 2. Experiments ¡ 3. Future ¡direc$on ¡

Synthesis ¡ 1. Carried ¡out ¡by ¡GenScript ¡ 2. Unstable ¡repeats ¡in ¡the ¡terminator ¡ region ¡( ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡) ¡caused ¡delays ¡ 3. pCC1 ¡plasmid ¡from ¡Epicentre ¡ Copy-­‑number ¡inducible ¡ • 4. ¡ ¡EPI300 ¡ E.Coli ¡strain ¡from ¡Epicentre ¡ For ¡stability ¡ • 5. ¡ ¡Codon ¡op$miza$on ¡

Experiments ¡ 1. Construct ¡2 ¡“Ac$vator” ¡ ON ¡ Protocol ¡ 1. Overnight ¡cultures ¡grown ¡for ¡a ¡few ¡hours ¡to ¡O.D. ¡ 0.4-­‑0.6 ¡at ¡single ¡copy ¡number ¡ 2. pCC1 ¡Induced ¡to ¡high ¡copy ¡number ¡with ¡L-­‑ arabinose ¡for ¡3-­‑4 ¡hours ¡ ¡ Expected ¡ Fluorescence ¡

Experiments ¡ 1. Construct ¡1 ¡“Inhibitor” ¡ OFF ¡ Protocol ¡ 1. Overnight ¡cultures ¡grown ¡for ¡a ¡few ¡hours ¡to ¡O.D. ¡ 0.4-­‑0.6 ¡at ¡single ¡copy ¡number ¡ 2. pCC1 ¡Induced ¡to ¡high ¡copy ¡number ¡with ¡L-­‑ arabinose ¡for ¡another ¡3-­‑4 ¡hours ¡ ¡ Unexpected ¡ Fluorescence… ¡

Why ¡did ¡construct ¡2 ¡fluoresce? ¡ 1. RhlR+C4 ¡promoter ¡leaky? ¡ 2. Long ¡incuba$on ¡$mes, ¡accumulated ¡ ECFP? ¡ 3. others? ¡

Future ¡experiments ¡ 1. Determine ¡the ¡Transfer ¡Func$on ¡of ¡lux ¡ pL ¡and ¡RhlR+C4 ¡transfer ¡func$ons ¡ exogenous ¡HSL ¡vs ¡fluorescence ¡ • fluorescence ¡ [HSL] ¡

Future ¡experiments ¡ ¡2. ¡Constructs ¡1 ¡and ¡2 ¡can ¡be ¡used ¡as ¡ receivers ¡for ¡HSLs ¡ For ¡example, ¡to ¡determine ¡the ¡rate ¡of ¡ • diffusion ¡of ¡HSLs ¡in ¡various ¡media ¡ lawn ¡of ¡ E. ¡Coli ¡ A ¡drop ¡of ¡ containing ¡ HSL ¡ Constructs ¡1 ¡or ¡2 ¡

Future ¡experiments ¡ ¡3. ¡Test ¡the ¡system ¡as ¡a ¡whole. ¡ ¡