The HOPE-project HBV polymerase as biomarker of antiviral - PowerPoint PPT Presentation

“AREVIR-GenaFor-Meeting”, Bonn, 03. May 2012 The HOPE-project HBV polymerase as biomarker of antiviral resistance Dieter Glebe Institute for Medical Virology National Reference Centre for Hepatitis B and D Viruses Justus-Liebig-Universität Gießen, Germany

Available Nucleos(t)id-Analoga (HBV) Nucleosid-Analoga Resistance Lamivudin 100 mg/d 80 % after 5 years 1.2 % after 5 years 1 Entecavir 0,5 mg/d 22 % after 2 years 2 Telbivudin 1,0 mg/d Nucleotid-Analoga Adefovir dipivoxil 10 mg/d 30 % after 5 years Tenofovir disoproxil 245 mg/d 0 % after 2 years 1 treatment-naive patients 2 HBeAg positive patients aus: Schaefer, Glebe, Gerlich. Hepatitis B Virus ; in: Doerr & Gerlich, Medizinische Virologie, 2010

HBV Polymerase Zoulim & Locarnini, HBV resistance to nucleos(t)ide analogues . Gastroenterology, 2009, modified

HBV Polymerase Secondary ‐ Primary Resistance ‐ resistance mutations mutations Zoulim & Locarnini, HBV resistance to nucleos(t)ide analogues . Gastroenterology, 2009, modified

HBV Polymerase Secondary ‐ Primary Resistance ‐ resistance mutations mutations Zoulim & Locarnini, HBV resistance to nucleos(t)ide analogues . Gastroenterology, 2009, modified

HBV Polymerase Secondary ‐ Primary Resistance ‐ resistance mutations mutations Zoulim & Locarnini, HBV resistance to nucleos(t)ide analogues . Gastroenterology, 2009, modified

HBV genotypic assay Adapt treatment based on genotypic information Zoulim & Locarnini, HBV resistance to nucleos(t)ide analogues . Gastroenterology, 2009; 137:1593-1608

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HBV resistance: from genotype to phenotype BMBF project (2009 ‐ 2012): H epatitis B therapies o ptimized by p henotypic e valuation (HOPE) Goals: – Validate resistance profile of HBV polymerase as a biomarker – Rapid rating of HBV (antiviral)-mutants ( Geno2pheno ) – improved clinical outcome of antiviral therapy • Involved groups: • Helmholtz Zentrum München (HMGU) (Protzer), • Justus-Liebig-Universität-Giessen (JLU) (Glebe, Gerlich), • Universität Duisburg-Essen University (Roggendorf, Lu) • Universität zu Köln (Kaiser), • Humboldt Universität Berlin/ Charite (van Boemmel, Berg), • Medizinische Hochschule Hannover (MHH) (Manns, Wursthorn), • Max-Planck-Institut Saarbrücken (MPI) (Lengauer, Beggel) • Dade Behring/Siemens Medical Solutions Diagnostics GmbH Deutschland Leverkusen,

Replication cycle of hepatitis B virus

Replication cycle of hepatitis B virus

Replication cycle of hepatitis B virus

Replication cycle of hepatitis B virus Formation Resistant of cccDNA Virus MVB Secretion Nukleos(t)id-Analoga of virions

HBV resistance: from genotype to phenotype Phenotypic in vitro resistance assay Expression plasmid with HBV ‐ Insert Pol ‐ frame amplicon from patients serum Wildtype pCH9 ‐ 3091 pCH9 ‐ 3091

HBV resistance: from genotype to phenotype Wildtype Wildtype Wildtype Transfection of HuH7 ‐ cells pCH9-3091 pCH9-3091 pCH9-3091 pCH9-3091 Wildtype Wildtype Wildtype e t a pCH9-3091 pCH9-3091 pCH9-3091 pCH9-3091 pCH9-3091 pCH9-3091 pCH9-3091 l p l l pCH9-3091 pCH9-3091 pCH9-3091 e w 6 9 n i l l e l w l e / w l µ / ‐ incubation for 3 days s 0 l 0 l e 1 c f 0 o ‐ incubate over night 0 e 0 r e . 0 h 4 t ‐ purify DNA from supernatant ~ ‐ wash cells ‐ quantify DNA with Real time PCR

HBV resistance: from genotype to phenotype Adefovir Entecavir Lamivudin Tenofovir no drug ‐ 72 datapoints for every clinical isolate

HBV resistance: from genotype to phenotype WT-Adefovir WT-Entecavir 1,4 1,2 1,2 1 relative replication relative replication 1 0,8 0,8 0,6 0,6 0,4 0,4 0,2 0,2 0 0 0,01 0,1 1 10 100 1000 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 100000 Adefovir [nM] Entecavir [nM] WT-Lamivudin WT-Tenofovir 1,2 1,4 1,2 1 relative replication relative replication 1 0,8 0,8 0,6 0,6 0,4 0,4 0,2 0,2 0 0 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 100000 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 100000 Lamivudin [nM] Tenofovir [nM]

HBV resistance: from genotype to phenotype WT-Adefovir WT-Entecavir 1,4 1,2 1,2 1 relative replication relative replication 1 0,8 0,8 0,6 0,6 0,4 0,4 0,2 0,2 0 0 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 100000 0,01 0,1 1 10 100 1000 Adefovir [nM] Entecavir [nM] WT-Lamivudin WT-Tenofovir 1,4 1,4 1,2 1,2 relative replication relative replication 1 1 0,8 0,8 0,6 0,6 0,4 0,4 0,2 0,2 0 0 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 100000 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 100000 Lamivudin [nM] Tenofovir [nM]

HBV resistance: from genotype to phenotype 1.day Cloning Wildtype Wildtype Wildtype pCH9-3091 pCH9-3091 pCH9-3091 pCH9-3091 pCH9-3091 pCH9-3091 pCH9-3091 3.day ‐ Transfection of cells 4.day ‐ 96 ‐ well ‐ format ‐ Incubation for 3 day ‐ Determination of transfection ‐ efficiency ‐ Automated purification of DNA from 7.day cell culture supernatant ‐ Quantification of viral HBV ‐ DNA 8.day using discriminative quantitative PCR

HBV resistance: the phenotype Resistance factor fitness Isolate Resistance GT in % ADV ETV LMV TDF none Wildtype 1,0 1,0 1,0 1,0 100 D P19 RK-16-1 204I A 1,5 5,6 >1110 0,6 5,7 P20 KW-WH2-34 80I,204I D 0,8 24,9 >1110 0,4 79,8 P21 FvB-170-5 80I,204I D 1,1 3,5 680,4 1,5 50,9 P22 FvB-158-1 80V,204I D 1,6 11,5 >1110 1,3 59,6 P23 FvB-175-14 80V,204I D 2,2 76,1 >1110 1,0 47,6 P24 RK-16-3 80V,204I A 0,8 4,2 >1110 1,5 4,5 P25 RK-44 173L,204I D 4,2 220,6 >1110 2,4 20,3 P26 FvB-158-2 80V,173L,204I D 0,8 130,5 >1110 1,4 91,6 P27 RK-190-1 80V,180M,204I A 2,9 5,0 >1110 2,3 36,6 P28 RK-182-1 173L,180M,204I G 2,7 24,1 >1110 3,4 24,8

HBV resistance: the phenotype for Lamivudine Resistance factor fitness Isolate Resistance GT in % M204I ADV ETV LMV TDF none Wildtype 1,0 1,0 1,0 1,0 100 D P19 RK-16-1 204I A 1,5 5,6 >1110 0,6 5,7 P20 KW-WH2-34 80I,204I D 0,8 24,9 >1110 0,4 79,8 P21 FvB-170-5 80I,204I D 1,1 3,5 680,4 1,5 50,9 Clinical resistance P22 FvB-158-1 80V,204I D 1,6 11,5 >1110 1,3 59,6 P23 FvB-175-14 80V,204I D 2,2 76,1 >1110 1,0 47,6 ADV ETV LMV TDF P24 RK-16-3 80V,204I A 0,8 4,2 >1110 1,5 4,5 none low yes none P25 RK-44 173L,204I D 4,2 220,6 >1110 2,4 20,3 P26 FvB-158-2 80V,173L,204I D 0,8 130,5 >1110 1,4 91,6 P27 RK-190-1 80V,180M,204I A 2,9 5,0 >1110 2,3 36,6 P28 RK-182-1 173L,180M,204I G 2,7 24,1 >1110 3,4 24,8 Resistance factor fitness Isolate Resistance GT in % ADV ETV LMV TDF P6 FvB-166-3 180M,204V B 1,8 24,1 >1110 1,4 2,9 P7 FvB-165-2 180M,204V A 0,7 28,3 >1110 2,5 92,7 P8 FvB-154-9 180M,204V A 1,3 15,8 >111 2,4 88,6 P9 FvB-157-1 180M,204V A 1,3 12,7 >111 5,6 45,2 P10 RK-224-5 180M,204V A 4,0 22,5 >1110 1,6 24,1 P11 RK-16-5 180M,204V A 3,0 9,6 >1110 2,6 10,3 P12 RK-172-2 180M,204V A 3,9 2,2 >1110 6,4 6,8 P13 RK-2-1 80V,180M,204V D 0,9 200,8 >1110 1,1 58,8 P14 FvB-175-9 173L,180M,204V D 1,0 2,9 >1110 2,6 2,6 P15 RK-172-3 173L,180M,204V A 3,0 4,4 >1110 2,4 10,4 P16 FvB-172-1 173L,180M,204V A 4,1 263,8 >1110 6,1 7,2 P17 FvB-154-2 173L,180M,204V A 5,2 10,0 >111 7,4 6,2 P18 FvB-169-4 173L,180M,204V A 1,1 10,2 >1110 2,5 1,7

HBV resistance: the phenotype for Lamivudine Resistance factor fitness Isolate Resistance GT in % L80I/V M204I ADV ETV LMV TDF none Wildtype 1,0 1,0 1,0 1,0 100 D P19 RK-16-1 204I A 1,5 5,6 >1110 0,6 5,7 P20 KW-WH2-34 80I,204I D 0,8 24,9 >1110 0,4 79,8 P21 FvB-170-5 80I,204I D 1,1 3,5 680,4 1,5 50,9 Clinical resistance P22 FvB-158-1 80V,204I D 1,6 11,5 >1110 1,3 59,6 P23 FvB-175-14 80V,204I D 2,2 76,1 >1110 1,0 47,6 ADV ETV LMV TDF P24 RK-16-3 80V,204I A 0,8 4,2 >1110 1,5 4,5 none low yes none P25 RK-44 173L,204I D 4,2 220,6 >1110 2,4 20,3 P26 FvB-158-2 80V,173L,204I D 0,8 130,5 >1110 1,4 91,6 P27 RK-190-1 80V,180M,204I A 2,9 5,0 >1110 2,3 36,6 P28 RK-182-1 173L,180M,204I G 2,7 24,1 >1110 3,4 24,8 Resistance factor fitness Isolate Resistance GT in % ADV ETV LMV TDF P6 FvB-166-3 180M,204V B 1,8 24,1 >1110 1,4 2,9 P7 FvB-165-2 180M,204V A 0,7 28,3 >1110 2,5 92,7 P8 FvB-154-9 180M,204V A 1,3 15,8 >111 2,4 88,6 P9 FvB-157-1 180M,204V A 1,3 12,7 >111 5,6 45,2 P10 RK-224-5 180M,204V A 4,0 22,5 >1110 1,6 24,1 P11 RK-16-5 180M,204V A 3,0 9,6 >1110 2,6 10,3 P12 RK-172-2 180M,204V A 3,9 2,2 >1110 6,4 6,8 P13 RK-2-1 80V,180M,204V D 0,9 200,8 >1110 1,1 58,8 P14 FvB-175-9 173L,180M,204V D 1,0 2,9 >1110 2,6 2,6 P15 RK-172-3 173L,180M,204V A 3,0 4,4 >1110 2,4 10,4 P16 FvB-172-1 173L,180M,204V A 4,1 263,8 >1110 6,1 7,2 P17 FvB-154-2 173L,180M,204V A 5,2 10,0 >111 7,4 6,2 P18 FvB-169-4 173L,180M,204V A 1,1 10,2 >1110 2,5 1,7