Single-cell RNA sequencing methodologies and ESCG pla:orm - PowerPoint PPT Presentation

Single-­‑cell ¡RNA ¡sequencing ¡ methodologies ¡and ¡ESCG ¡pla:orm ¡ Karolina ¡Wallenborg ¡ October ¡2, ¡2017 ¡

From ¡Wikipedia ¡

Short ¡history ¡of ¡scRNA-­‑seq ¡ 10XGenomics ¡ BioRad/Illumina ¡ BD ¡Resolve ¡ Adapted ¡from: ¡Kolodziejczyk ¡A ¡et ¡al, ¡Molecular ¡Cell, ¡2015 ¡

ApplicaTons ¡for ¡scRNA-­‑sequencing ¡ • Heterogeneity ¡analysis ¡ • Cell ¡type ¡idenTficaTon ¡ • Lineage ¡tracing, ¡cellular ¡states ¡in ¡differenTaTon ¡and ¡ development ¡ • Monoallelic ¡gene ¡expression, ¡splicing ¡paZerns ¡ ¡ Zeisel ¡A, ¡et ¡al, ¡Science ¡2015 ¡

Single-­‑cell ¡isolaTon ¡or ¡capture ¡ MulT-­‑Sample ¡ Nano-­‑ Dispenser ¡ Micro-­‑well ¡chip ¡ Adapted ¡from: ¡Kolodziejczyk ¡A ¡et ¡al, ¡Molecular ¡Cell, ¡2015 ¡ Cytoplasmic ¡aspiraTon ¡

Reverse ¡transcripTon ¡and ¡amplificaTon ¡ Adapted ¡from: ¡Kolodziejczyk ¡A ¡et ¡al, ¡Molecular ¡Cell, ¡2015 ¡ • Poly(T) ¡primer ¡ • Single ¡cell ¡contain ¡~10 ¡pg ¡total ¡RNA ¡ • 1-­‑5% ¡is ¡mRNA ¡ • 10-­‑20% ¡of ¡the ¡transcripts ¡get ¡reverse ¡transcribed ¡

Current ¡scRNA-­‑sequencing ¡protocols ¡ Adapted ¡from ¡Poulin ¡JF ¡et ¡al, ¡Nature ¡Neuroscience, ¡2016 ¡

Single-­‑cell ¡RNA-­‑sequencing ¡protocols ¡ -­‑Which ¡method ¡suits ¡you? ¡ • Full-­‑length ¡ • Tag-­‑based ¡methods ¡(5’ ¡or ¡3’) ¡ – Whole ¡transcript ¡ – EsTmate ¡of ¡transcript ¡abundance ¡ informaTon ¡ – Early ¡mulTplexing ¡ – Gene ¡expression ¡ – Combined ¡with ¡molecular ¡ quanTficaTon ¡ counTng ¡ – Isoform, ¡SNP ¡and ¡ – Retain ¡DNA ¡strand ¡informaTon ¡ mutaTons ¡ ¡ ¡

¡ • 77 ¡projects ¡ • 280,000 ¡single ¡cells ¡sequenced ¡ • High ¡throughput ¡single-­‑cell ¡RNA-­‑sequencing ¡ • Sten ¡Linnarsson ¡(STRT-­‑seq, ¡STRT/C1), ¡Rickard ¡Sandberg ¡ • Started ¡in ¡2015 ¡ (Smart-­‑seq2) ¡ 10 ¡ 12 ¡ 0 ¡ 2 ¡ 4 ¡ 6 ¡ 8 ¡ Oligodendrocytes ¡ ESCG ¡pla:orm ¡ Breast ¡Cancer ¡Cells ¡ Brain ¡cells ¡ Ependymal ¡cells ¡ Cardiomyocytes ¡ Neurons ¡ KeraTnocytes ¡ GBM ¡cells ¡ Neural ¡Crest ¡Cells ¡ Innate ¡Lymphoid ¡Cells ¡ Number ¡of ¡projects ¡per ¡cell ¡type ¡ Blastema ¡Cells ¡ ES ¡Cells ¡ Immune ¡Cells ¡ CAFs ¡ Endothelial ¡Cells ¡ Pericytes ¡ SpermaTds ¡ Fibroblasts ¡ Pancreas ¡cells ¡ Mesenchymal ¡Cells ¡ Smooth ¡muscle ¡Cells ¡ CLL ¡tumor ¡Cells ¡ Epithelial ¡Cells ¡ Bone ¡marrow ¡Cells ¡ Kidney ¡Cells ¡ Microglia ¡ Thymic ¡Cells ¡ Macrophages ¡ Liver ¡ Astrocytes ¡ Endothelial ¡Cells ¡ Leukemia ¡Cells ¡ IPS ¡Cells ¡ Cancer ¡Cell ¡line ¡ Tongue ¡Cells ¡

How ¡do ¡you ¡get ¡started? ¡ User ¡meeTng ¡ – Project ¡discussion ¡ • Feasibility ¡ • Tissue, ¡cells ¡ How ¡many ¡cells ¡ And ¡how ¡deep ¡ must ¡I ¡analyze? ¡ must ¡I ¡ • Project ¡size ¡ sequence ¡? ¡ • Time ¡line ¡ – Choice ¡of ¡method ¡ • Data ¡output ¡ • Number ¡of ¡cells ¡to ¡be ¡analyzed ¡ • LocaTon, ¡cell ¡delivery ¡ – BioinformaTcs ¡ • Early ¡contact ¡ • NaTonal ¡BioinformaTcs ¡Infrastructure ¡Sweden ¡(NBIS) ¡ – Data ¡delivery ¡ – User ¡fees ¡

Single ¡cell ¡submission ¡guidelines ¡ OpTmize ¡your ¡cell ¡isolaTon ¡protocol ¡ – Limit ¡Tme ¡of ¡isolaTon ¡ – Be ¡gentle ¡ Single ¡cell ¡suspension ¡criteria ¡ – High ¡viability ¡(>80%) ¡ – No ¡cell ¡clumps ¡or ¡debris ¡ – Cell ¡strain ¡and ¡wash ¡ FACS ¡facility ¡ – Cell ¡viability ¡stain ¡ Visit ¡us ¡ – Single ¡cell ¡suspension ¡quality ¡control ¡

Smart-­‑seq2 ¡at ¡ESCG ¡ • 384 ¡well ¡plates ¡ • IsolaTon: ¡FACS ¡ • Input: ¡cells/nuclei ¡ • Full-­‑length ¡ • Sequencing: ¡50bp ¡single-­‑read ¡ • ERCC ¡spike-­‑ins ¡ – Two ¡different ¡diluTons ¡ • Flexible ¡delivery ¡ ¡

STRT-­‑seq-­‑2i: ¡dual-­‑index ¡5’ ¡single-­‑cell ¡ ¡ RNA-­‑sequencing ¡ Adapted ¡from: ¡Hochgerner ¡H, ¡et ¡al, ¡BioRxiv, ¡2017 ¡ • IsolaTon: ¡FACS/dispensing ¡ • Input: ¡Cells/nuclei ¡ • Scale: ¡9600 ¡cells ¡(~2500 ¡cells) ¡ • Sequencing: ¡5’-­‑tag ¡(50 ¡bp ¡single ¡read) ¡ • Up ¡to ¡8 ¡samples ¡in ¡parallel ¡ • No ¡size ¡limitaTon ¡ • UMI:s ¡

10X ¡Genomics ¡ -­‑Drop-­‑seq ¡technology ¡ • IsolaTon: ¡Droplets ¡ • Input: ¡Cells/nuclei ¡ • Scale: ¡500-­‑10,000 ¡x ¡8 ¡ • Sequencing: ¡3’-­‑tag ¡ (HiSeq2500/NovaSeq) ¡ • Up ¡to ¡8 ¡samples ¡in ¡parallel ¡ • Validated ¡up ¡to ¡30μm ¡ (channels ¡50μm) ¡ • UMI, ¡cell ¡barcode, ¡sample ¡ barcode ¡ • CellRanger, ¡Loupe, ¡R-­‑package ¡

Comparing ¡our ¡services ¡ Full-­‑length ¡ Quan?ta?ve ¡ Smart-­‑seq2 ¡ STRT-­‑Wafergen ¡ 10xGenomics ¡ Chromium ¡ Eppendorf ¡ ¡ Format ¡ Microwell ¡chip ¡ microfluidics ¡chip ¡ Twin-­‑tek ¡ ¡ Cell ¡number ¡ 384 ¡ 9,600 ¡(~2,500) ¡ 8 ¡x ¡500-­‑10,000 ¡ Input ¡ FACS-­‑sorted ¡cells ¡ Suspension ¡ Suspension ¡ Transcript ¡ Full-­‑length ¡ 5’ ¡ 3’ ¡ coverage ¡ Features ¡ Flexible ¡delivery ¡ LimiTng ¡diluTon/ High ¡throughput ¡ • • • Isoforms, ¡SNPs, ¡ FACS ¡ 8 ¡samples ¡parallel ¡ • • mutaTons ¡ Cell ¡selecTon ¡ Nuclei ¡ • • Nuclei ¡ Unbiased ¡ Sample ¡pooling ¡ • • • ERCC ¡spike-­‑ins ¡ 8 ¡samples ¡parallel ¡ ¡ • • Nuclei ¡ •

Data ¡delivery ¡ • Sequencing ¡at ¡NGI, ¡HiSeq2500, ¡NovaSeq ¡ • Analysis ¡pipelines ¡for ¡mouse ¡and ¡human ¡ – In-­‑house: ¡STRT, ¡smart-­‑seq2 ¡ – Cell ¡ranger: ¡10xGenomics ¡ • UPPMAX, ¡BioinformaTcs ¡compute ¡and ¡storage ¡ – Users ¡apply ¡individually ¡for ¡projects ¡ ¡ – Annotated ¡gene ¡expression ¡data, ¡QC-­‑files, ¡Fastq ¡ • BioinformaTcs ¡ – Done ¡by ¡user ¡ – Support ¡from ¡BILS ¡and ¡WABI ¡ – CollaboraTons ¡ ¡

User ¡fees ¡ Smart-­‑seq2 ¡ STRT-­‑Wafergen ¡ 10XGenomics ¡ ¡ ¡ ¡ 384 ¡well ¡plate ¡ 9600 ¡wells ¡chip ¡ 1 ¡sample ¡ ¡ (~2,500 ¡cells) ¡ (~3,000 ¡cells) ¡ ValidaTon ¡ ValidaTon ¡ ValidaTon ¡ • • • Smart-­‑seq2 ¡ STRT ¡library ¡(dual ¡ Illumina ¡library ¡ • • • library ¡ ¡ index) ¡ Sequencing ¡ • Sequencing ¡ ¡ Sequencing ¡(50 ¡bp ¡ (paired-­‑end, ¡dual ¡ • • (50 ¡bp, ¡single-­‑ single-­‑read) ¡ index) ¡ • read ¡ ~40,000 ¡SEK ¡ ~50,000 ¡SEK ¡ ~42,000 ¡SEK ¡ Costs ¡include: ¡ Reagents, ¡consumables, ¡instrument ¡depreciaTon, ¡instrument ¡ service, ¡personnel. ¡Overhead ¡is ¡not ¡included. ¡

ESCG ¡StaTsTcs ¡ Monkey, ¡2 ¡ Hydra, ¡1 ¡ Zebrafish, ¡ Pig, ¡1 ¡ 1 ¡ Newt, ¡2 ¡ Smart-­‑seq2, ¡ 10X ¡ Mouse ¡, ¡37 ¡ 95500 ¡ Genomics, ¡ Human, ¡33 ¡ 158500 ¡ STRT-­‑C1 ¡ (Fluidigm), ¡ 6729 ¡ STRT-­‑seq-­‑2i ¡ (Wafergen), ¡ InternaTonal ¡ 21282 ¡ LICR ¡ SU ¡ Lund ¡ UU ¡ KI, ¡Huddinge ¡ KI, ¡Solna ¡

What ¡lays ¡ahead? ¡ • Emerging ¡techniques ¡ – Single ¡nuclei ¡RNA-­‑sequencing ¡ – Single ¡cell ¡ATAC-­‑seq ¡ – Transcriptome ¡+ ¡Epigenome ¡ – Transcriptome ¡+ ¡Proteome ¡ – CRISPR-­‑Cas9 ¡+ ¡Transcriptome ¡ – ‘split-­‑pooling’ ¡scRNA-­‑seq ¡ ¡ • ValidaTon ¡ – Small ¡molecule ¡FISH ¡ • Human ¡Cell ¡Atlas ¡

The STRT/C1 method mRNA AAAAAAAA C1-P1-T 31 TTTTTTTTT PvuI site biotin RT & template switching C1-P1-TSO UMI r G r G r G AAAAAAAA C C C TTTTTTTTT cDNA ampli fj cation C1-P1-PCR GGG AAAAAAAA CCC TTTTTTTTT C1-P1-PCR Tagmentation GGG AAAAAAAA CCC TTTTTTTTT Illumina P2 GGG CCC Cell barcode AAAAAAAA TTTTTTTTT Streptavidin bead separation - pooling - PvuI restriction GGG CCC AAAAAAAA TTTTTTTTT Sequencing GGG CCC Read 2 Read 1 Modified from: Picelli (2016), RNA Biology, July 21: 1-14