RNA-‑seq ¡Introduc1on ¡ Promises ¡and ¡pi7alls ¡
RNA ¡gives ¡informa1on ¡on ¡which ¡genes ¡ that ¡are ¡expressed ¡ How ¡DNA ¡get ¡transcribed ¡to ¡ RNA ¡(and ¡some1mes ¡then ¡ translated ¡to ¡proteins) ¡varies ¡ between ¡e. ¡g. ¡ ¡ -‑Tissues ¡ ¡ -‑ Cell ¡types ¡ -‑ Cell ¡states ¡ -‑Individuals ¡ ¡ -‑Cells ¡
RNA ¡gives ¡informa1on ¡on ¡which ¡genes ¡ that ¡are ¡expressed ¡ How ¡DNA ¡get ¡transcribed ¡to ¡ RNA ¡(and ¡some1mes ¡then ¡ translated ¡to ¡proteins) ¡varies ¡ between ¡e. ¡g. ¡ ¡ -‑Tissues ¡ ¡ -‑ Cell ¡types ¡ -‑ Cell ¡states ¡ -‑Individuals ¡
RNA ¡gives ¡informa1on ¡on ¡which ¡genes ¡ that ¡are ¡expressed ¡ How ¡DNA ¡get ¡transcribed ¡to ¡ RNA ¡(and ¡some1mes ¡then ¡ translated ¡to ¡proteins) ¡varies ¡ between ¡e. ¡g. ¡ ¡ -‑Tissues ¡ ¡ -‑ Cell ¡types ¡ -‑ Cell ¡states ¡ -‑Individuals ¡
RNA ¡flavors ¡ ¡ (pre ¡sequencing ¡era) ¡ • House ¡keeping ¡RNAs ¡ – rRNAs, ¡tRNAs, ¡snoRNAs, ¡ snRNAs, ¡SRP ¡RNAs, ¡ cataly1c ¡RNAs ¡(RNAse ¡E) ¡ • Protein ¡coding ¡RNAs ¡ – (1 ¡coding ¡gene ¡~ ¡1 ¡mRNA) ¡ • Regulatory ¡RNAs ¡ – Few ¡rare ¡examples ¡
ENCODE, ¡the ¡Encyclopedia ¡of ¡DNA ¡Elements, ¡is ¡a ¡project ¡funded ¡by ¡the ¡Na1onal ¡ Human ¡Genome ¡Research ¡Ins1tute ¡to ¡iden1fy ¡all ¡regions ¡of ¡transcrip1on, ¡ transcrip1on ¡factor ¡associa1on, ¡chroma1n ¡structure ¡and ¡histone ¡modifica1on ¡in ¡ the ¡human ¡genome ¡sequence. ¡
ENCyclopedia ¡Of ¡Dna ¡Elements ¡
Different ¡kind ¡of ¡RNAs ¡have ¡different ¡ expression ¡values ¡ Landscape ¡of ¡transcrip/on ¡in ¡human ¡ cells, ¡S ¡Djebali ¡ et ¡al. ¡ Nature ¡2012 ¡ ¡
What ¡defines ¡RNA ¡depends ¡on ¡how ¡ you ¡look ¡at ¡it ¡ ¡ Coverage ¡ Variants ¡ Abundance ¡ House ¡keeping ¡RNAs ¡ mRNAs ¡ Regulatory ¡RNAs ¡ Novel ¡intergenic ¡ None ¡ Adapted ¡from ¡ Landscape ¡of ¡transcrip/on ¡in ¡ human ¡cells, ¡S ¡Djebali ¡ et ¡al. ¡ Nature ¡2012 ¡ ¡
Defining ¡func1onal ¡DNA ¡elements ¡in ¡ the ¡human ¡genome ¡ ¡ Statement ¡ Consequence ¡ • • – A ¡priori , ¡we ¡should ¡not ¡expect ¡the ¡ – Thus, ¡one ¡should ¡have ¡high ¡ transcriptome ¡to ¡consist ¡ confidence ¡that ¡the ¡subset ¡of ¡the ¡ exclusively ¡of ¡func1onal ¡RNAs. ¡ ¡ genome ¡with ¡large ¡signals ¡for ¡RNA ¡ or ¡chroma1n ¡signatures ¡coupled ¡ Why ¡is ¡that ¡ • with ¡strong ¡conserva1on ¡is ¡ – Zero ¡tolerance ¡for ¡errant ¡ func1onal ¡and ¡will ¡be ¡supported ¡by ¡ transcripts ¡would ¡come ¡at ¡high ¡ appropriate ¡gene1c ¡tests. ¡ ¡ cost ¡in ¡the ¡proofreading ¡machinery ¡ – In ¡contrast, ¡the ¡larger ¡propor1on ¡ needed ¡to ¡perfectly ¡gate ¡RNA ¡ of ¡genome ¡with ¡reproducible ¡but ¡ polymerase ¡and ¡splicing ¡ac1vi1es, ¡ low ¡biochemical ¡signal ¡strength ¡ or ¡to ¡instantly ¡eliminate ¡spurious ¡ and ¡less ¡evolu1onary ¡conserva1on ¡ transcripts. ¡ is ¡challenging ¡to ¡parse ¡between ¡ – In ¡general, ¡sequences ¡encoding ¡ specific ¡func1ons ¡and ¡biological ¡ RNAs ¡transcribed ¡by ¡noisy ¡ noise. ¡ transcrip1onal ¡machinery ¡are ¡ ¡ expected ¡to ¡be ¡less ¡constrained, ¡ which ¡is ¡consistent ¡with ¡data ¡ shown ¡here ¡for ¡very ¡low ¡ abundance ¡RNA ¡ ¡ ¡
This ¡is ¡of ¡course ¡not ¡without ¡an ¡debate ¡ Variants ¡ Abundance ¡ Most ‘‘Dark Matter’’ Transcripts Are Associated With Known Genes Perspective Harm van Bakel 1 , Corey Nislow 1,2 , Benjamin J. Blencowe 1,2 , Timothy R. Hughes 1,2 * 1 Banting and Best Department of Medical Research, University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada, 2 Department of Molecular Genetics, University of Toronto, Toronto, The Reality of Pervasive Transcription Ontario, Canada Abstract Michael B. Clark 1 , Paulo P. Amaral 1 . , Felix J. Schlesinger 2 . , Marcel E. Dinger 1 , Ryan J. Taft 1 , John L. Perspective Rinn 3 , Chris P. Ponting 4 , Peter F. Stadler 5 , Kevin V. Morris 6 , Antonin Morillon 7 , Joel S. Rozowsky 8 , A series of reports over the last few years have indicated that a much larger portion of the mammalian genome is transcribed than can be accounted for by currently annotated genes, but the quantity and nature of these additional Mark B. Gerstein 8 , Claes Wahlestedt 9 , Yoshihide Hayashizaki 10 , Piero Carninci 10 , Thomas R. Gingeras 2 * , transcripts remains unclear. Here, we have used data from single- and paired-end RNA-Seq and tiling arrays to assess the Response to ‘‘The Reality of Pervasive Transcription’’ John S. Mattick 1 * quantity and composition of transcripts in PolyA + RNA from human and mouse tissues. Relative to tiling arrays, RNA-Seq 1 Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, Brisbane, Queensland, Australia, 2 Watson School of Biological Sciences, Cold Spring Harbor Laboratory, Harm van Bakel 1 , Corey Nislow 1,2 , Benjamin J. Blencowe 1,2 , Timothy R. Hughes 1,2 * Cold Spring Harbor, New York, United States of America, 3 Broad Institute, Cambridge, Massachusetts, United States of America, 4 MRC Functional Genomics Unit, Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, Oxford, United Kingdom, 5 Department of Computer Science, University of Leipzig, Leipzig, 1 Banting and Best Department of Medical Research and Terrence Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, Toronto, Ontario, Germany, 6 Department of Molecular and Experimental Medicine, Scripps Research Institute, La Jolla, California, United States of America, 7 Institut Curie, UMR3244- Canada, 2 Department of Molecular Genetics, University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada Pavillon Trouillet Rossignol, Paris, France, 8 Computational Biology and Bioinformatics, Yale University, New Haven, Connecticut, United States of America, 9 University of Miami, Miami, Florida, United States of America, 10 Omics Science Center, RIKEN Yokohama Institute, Tsurumi-ku, Yokohama, Kanagawa, Japan Clark et al. criticize several aspects of tic’’ transcripts greatly increases their emphasized the lack of abundant pervasive our study [1], and specifically challenge abundance [7,8]. transcription in our study. Clark et al. cite our assertion that the degree of pervasive We acknowledge that the phrase quoted papers that have previously documented transcription has previously been overstat- by Clark et al. in our Author Summary pervasive transcription, and point out that should have read ‘‘stably transcribed’’, or several different approaches have been ed. We disagree with much of their
Biochemical ¡evidence ¡not ¡enough ¡to ¡ iden1fy ¡func1onal ¡RNAs ¡ Defining functional DNA elements in the human genome Kellis M et al. PNAS 2014;111:6131-6138
One ¡gene ¡many ¡different ¡mRNAs ¡
• RNA ¡seq ¡course ¡ ¡ ¡
The ¡RNA ¡seq ¡course ¡ • From ¡RNA ¡seq ¡to ¡reads ¡ • Mapping ¡reads ¡programs ¡ • Transcriptome ¡reconstruc1on ¡using ¡reference ¡ • Transcriptome ¡reconstruc1on ¡without ¡reference ¡ • QC ¡analysis ¡ ¡ • sRNA ¡analysis ¡ • Differen1al ¡expression ¡analysis ¡ – mRNAs ¡ ¡ – miRNAs ¡ • Genome ¡annota1on ¡using ¡RNA ¡and ¡other ¡sources ¡ • Differen1al ¡expression ¡using ¡mul1-‑variate ¡analysis ¡ • RNA ¡long ¡read ¡analysis ¡
From ¡RNA ¡to ¡short ¡reads ¡
Sequencing ¡pla7orms ¡ ABI ¡3730xl ¡ 454 ¡Life ¡Sciences ¡ SOLiD ¡+ ¡ Pacific ¡Biosciences, ¡ Sanger ¡Sequencing ¡ pyrosequencing ¡ Illumina ¡ Oxford ¡Nanopore ¡etc ¡ Single-‑molecule ¡ ¡ sequencing ¡ Length/read ¡800 ¡bp ¡ ¡ ¡ ¡400 ¡bp ¡ ¡ ¡100 ¡bp ¡ ¡20 ¡000+ ¡bp ¡ Reads/run ¡ ¡ ¡96 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡1 ¡million ¡ ¡ ¡2 ¡billion ¡ ¡5 ¡million ¡ Bases/run ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡60 ¡kbp ¡ ¡ ¡ ¡400 ¡Mbp ¡ ¡ ¡500 ¡Gbp ¡ ¡100 ¡Gbp ¡ ¡ Speed ¡ ¡10 ¡years/HG ¡ ¡ ¡1 ¡month/HG ¡ ¡1 ¡day/HG ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡10 ¡min/HG ¡ “ 3 rd ¡gen ” ¡ “ Old ¡school ” ¡ “ 2 nd ¡gen ” ¡
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