MAST BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016 DEPArray User Meeting Dissecting - PowerPoint PPT Presentation

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DEPArray™ User Meeting Dissecting the Heterogeneity of Circulating Tumor Cells in the Metastastic Breast Cancer Daniela Cesselli, University of Udine MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016

DEPArray™ User Meeting MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016

F IGURE 1 MINIMALLY INVASIVE APPROACHES TO MONITOR TUMOR GENOME EVOLUTION. � ( A ) C IRCULATING TUMOR CELLS (CTC S ; BLUE ) ARE ISOLATED FROM TOTAL BLOOD CELLS BY CELL SEPARATION SYSTEMS . C ELL LYSIS YIELDS PURE TUMOR DNA ( GRAY ) AND RNA ( BLACK ); FOR ANALYSIS OF TUMOR - SPECIFIC MUTATIONS , THESE ARE SUBJECTED TO WHOLE - GENOME OR WHOLE - TRANSCRIPTOME AMPLIFICATION , RESPECTIVELY (WGA, WTA). P ROTEINS IN CTC S CAN BE ANALYZED BY IMMUNOHISTOCHEMISTRY AND , IF VIABLE , CTC S CAN BE SUBJECTED TO FUNCTIONAL ANALYSES 8. � ( B ) C ELL - FREE DNA ( CF DNA ) IS PREPARED FROM PLASMA BY SEVERAL CENTRIFUGATION AND FILTRATION STEPS .T HE RESULTING DNA IS A MIXTURE OF DNA FRAGMENTS RELEASED FROM NONMALIGNANT CELLS ( BROWN ) AND FROM TUMOR CELLS ( CT DNA; BLUE ). � ( C ) E XOSOMES CAN BE EFFICIENTLY CAPTURED FROM BLOOD USING THE N PLEX ASSAY AND THEIR MOLECULAR CONSTITUENTS ANALYZED ; � FOR EXAMPLE , PROTEINS CAN BE QUANTIFIED BY N PLEX, AND RNA CAN BE QUANTIFIED OR SEQUENCED . MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016

CTC: open questions  BEYOND ¡ EPCAM ¡  BEYOND ¡ENUMERATION: ¡ CHARACTERIZATION ¡  EPITHELIAL ¡TO ¡MESENCHYMAL ¡TRANSITION ¡  DRUG-­‑SENSITIVITY ¡(e.g. ¡HER-­‑2, ¡ER, ¡PR) ¡  SINGLE ¡CELL ¡GENOMICS ¡  VIABLE ¡CELL ¡SORTING MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016

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AIMS o o o o o MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016

DEPA RRAY - BASED PLATFORM Sample ¡ ¡ RBC ¡ LYSIS ¡ S TAINING ¡ WITH ¡ AN ¡ ANTIBODY ¡ COCKTAIL ¡ RECOGNIZING ¡ EPITHELIAL ¡ D EPLETION ¡ OF ¡CD45+ ¡ ¡ AND ¡ MESENCHYMAL ¡CTC ¡ C ELLS ¡ P ERIPHERAL ¡ E NRICHMENT ¡ BLOOD ¡ OUTPUT ¡ E NRICHED ¡CTC S ¡ S ORTING ¡ 1. CTC ¡ QUANTIFICATION ¡ 2. CTC ¡ CHARACTERIZATION : ¡ E PITHELIAL ¡/ ¡M ESENCHYMAL ¡CTC ¡ ¡ A MPLI 1™ D OWNSTREAM ¡ ¡ V IABLE ¡CTC S ¡ W HOLE G ENOME 3. VIABLE ¡ CELLS ¡ FOR ¡ DOWNSTREAM ¡ A MPLIFICATION A NALYSES ¡ ANALYSES ¡ M RNA R EAL T IME 4. C ORRELATION ¡ WITH ¡ CLINICAL ¡ DATA ¡ A NALYSIS MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016 P ROTEINS

OPTIMIZATION ¡OF ¡THE ¡EXPERIMENTAL ¡ PLATFORM ¡TO ¡ISOLATE ¡AND ¡SORT ¡CTC S ¡ 1) ¡E PITHELIAL ¡ AND ¡ MESENCHYMAL ¡CTC ¡ 2) ¡V IABLE ¡CTC S ¡ FOR ¡ DOWNSTREAM ¡ ANALYSES ¡( PROTEIN , ¡DNA, ¡RNA S ….) ¡ 1. ¡ENRICHMENT ¡PROCEDURE ¡(7.5 ¡ML ¡BLOOD) ¡ 1. RBC ¡ LYSIS ¡ 2. D EPLETION ¡ OF ¡CD45 + /GLYCOFORIN + ¡C ELLS ¡(MILTENYI) ¡ P ERIPHERAL ¡ BLOOD ¡ CD45 ¡NEG ¡ CD45 ¡POS ¡ 99.98 ¡± ¡0.012 ¡ % ¡ Dr. ¡MICHELA ¡BULFONI ¡ MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016

1. ¡ENRICHMENT ¡PROCEDURE ¡(7.5 ¡ML ¡BLOOD) ¡ E-CAD PE E-CAD PE CTC S ¡ ER+ ¡ ENRICHED ¡ FROM ¡ PERIPHERAL ¡ BLOOD ¡ OF ¡ METASTATIC ¡ BREAST ¡ CANCER ¡ PATIENTS ¡ USING ¡ EpCAM EpCAM THE ¡ EXPERIMENTAL ¡ METHOD ¡ DESIGNED ¡ APC APC A FTER ¡RB ¡ LYSIS ¡ AND ¡CD45+ ¡ DEPLETION ¡ OF ¡ A ¡ SPIKED ¡ SAMPLE ¡(7.5 ¡ M L ¡PB+ ¡500’000 ¡ TUMOR ¡ CELLS ¡MCF-­‑7) ¡ ¡ WE ¡ FOUND ¡ ¡ IN ¡ THE ¡CD45-­‑ ¡ FRACTION ¡ 99.5% ¡ OF ¡ THE ¡ TUMOR ¡ CELLS . ¡ MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016

2. CTCs ¡DETECTION ¡STRATEGY: ¡ ANTIBODY ¡ COCKTAIL ¡ RECOGNIZING ¡ VIABLE ¡ ¡ EPITHELIAL -­‑ LIKE ¡( MCF -­‑7) ¡ AND ¡ MESENCHYMAL -­‑ LIKE ¡( MDA -­‑ MB ¡231) ¡ CELLS ¡ SPIKED ¡ IN ¡ HUMAN ¡ BLOOD ¡ MCF-7 MDA-MB231 -­‑ ¡ E P CAM ¡(M ILTENYI ¡B IOTECH ) ¡ COD . ¡130-­‑091-­‑254; ¡ -­‑ ¡ CD44 ¡ CLONE ¡G44-­‑26 ¡ (BD) ¡ COD . ¡347943; ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ -­‑ ¡ CD146 ¡(BD) ¡ COD . ¡550315; ¡ -­‑ ¡ N-­‑CAD ¡ CLONE ¡8C11 ¡ (BD) ¡ COD . ¡561554; ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ -­‑ ¡CD49 F ¡ CLONE ¡G O H3 ¡ (B IOLEGEND ) ¡ COD . ¡313615; ¡ -­‑ ¡ EGFR ¡ CLONE ¡AY13 ¡ (B IOLEGEND ); ¡ -­‑ ¡ CD133 ¡ CLONE ¡AC-­‑133 ¡ (M ILTENYI ¡B IOTECH ); ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ -­‑ ¡ CD45 ¡ CLONE ¡2D1 ¡ (BD) ¡ COD .345809. ¡ MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016

2. CTCs ¡DETECTION ¡STRATEGY: ¡ ANTIBODY ¡ COCKTAIL ¡ RECOGNIZING ¡ EPITHELIAL -­‑ LIKE ¡( MCF -­‑7) ¡ AND ¡ MESENCHYMAL -­‑ LIKE ¡( MDA -­‑ MB ¡231) ¡ CELLS ¡ SPIKED ¡ IN ¡ HUMAN ¡ BLOOD ¡ HOECHST ¡33342 ¡ H EALTHY ¡ FEMALE ¡ BLOOD ¡ DONORS ¡ EPITHELIAL STAINING ¡ MARKERS: E P CAM AND E- CAD NUCLEI ¡ ¡ CONJUGATED WITH FITC MESENCHYMAL LEUKOCYTE MARKES: MARKER: CD44, CD146 AND CD45 N- CAD CONJUGATED WITH APC CONJUGATED WITH PE SPIKED ¡SAMPLES ¡(n ¡= ¡27) ¡ SENSITIVITY ¡ SPECIFICITY ¡ PPV ¡ TOTAL ¡ 98.9±1.4% ¡ 99.2±1.6% ¡ 95±5.7% ¡ MCF-­‑7 ¡ 99.7±0.1% ¡ 98.4±2.1% ¡ 90±2.6% ¡ MDA-­‑231 ¡ 98±1.7% ¡ 99.9±0.1% ¡ 99.97±0.06% ¡ MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016

3. ¡DEVELOPMENT ¡OF ¡A ¡DEPARRAY-­‑BASED ¡PROTOCOL ¡TO ¡ DEPArray™ User Meeting DETECT ¡AND ¡SORT ¡SINGLE, ¡VIABLE, ¡EPITHELIAL ¡AND ¡ MESENCHYMAL ¡CELLS ¡ DEPARRAY ¡ ANALYSIS ¡ AND ¡ SORTING ¡ SPIKED ¡SAMPLES ¡ MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016

4. ¡USE ¡OF ¡THE ¡STRATEGY ¡ON ¡MBC ¡PATIENTS ¡ MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016

5. ¡CLINICAL ¡TRIAL: ¡METASTATIC ¡BREAST ¡CANCER ¡PATIENTS ¡ OBJECTIVE : ¡ OBSERVATIONAL ¡ STUDY ¡ TO ¡ EVALUATE ¡ 1. A SSOCIATION ¡ BETWEEN ¡CTC ¡ SUBPOPULATIONS ¡ AND ¡ CLINICOPATHOLOGICAL ¡ FEATURES ¡ 2. T HE ¡ PROGNOSTIC ¡ ROLE ¡ OF ¡CTC ¡ Oncology ¡Department ¡of ¡Udine ¡Hospital : ¡ Prof. ¡F. ¡Puglisi, ¡Dr. ¡L. ¡Gerratana ¡ ¡RECRUITMENT ¡CRITERIA ¡ 1. M EASURABLE ¡ METASTATIC ¡ BREAST ¡ CANCER ¡( RECIST ¡C RITERIA ); ¡ ¡ 2. B EGINNING ¡ OF ¡ A ¡ NEW ¡ LINE ¡ OF ¡ SYSTEMIC ¡ THERAPY , ¡ WITH ¡ NO ¡ RESTRICTIONS ¡ ON ¡ ANY ¡ PREVIOUS ¡ THERAPY ; ¡ ¡ 3. ECOG ¡ PERFORMANCE ¡ STATUS ¡ BETWEEN ¡0 ¡ AND ¡2; ¡ ¡ 4. A VAILABILITY ¡ OF ¡ A ¡ HISTOLOGICAL ¡ SPECIMEN ¡ OF ¡ THE ¡ PRIMARY ¡ TUMOR ¡ ¡BIOBANKING ¡AND ¡FOLLOW-­‑UP ¡ 1. S AMPLING : ¡ BEFORE ¡ THE ¡ NEW ¡ THERAPEUTIC ¡ LINE , ¡ AT ¡ THE ¡ FIRST ¡ CLINICAL -­‑ RADIOLOGICAL ¡ FOLLOW -­‑ UP , ¡ AT ¡ PROGRESSION ¡ 2. C OLLECTION ¡ AND ¡ STORAGE ¡ OF ¡ PLASMA ¡ SAMPLE ¡ ALIQUOTS ¡ FOR ¡ EXOSOME ¡ AND ¡ BIOMARKER ¡ ANALYSIS ; ¡ 3. U P -­‑ DATED ¡ CLINICAL ¡ DATABASE ¡(OS, ¡PFS, ¡ DRUG ¡ RESPONSE ) ¡ MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016

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5. ¡CLINICAL ¡TRIAL: ¡PROGNOSTIC ¡ROLE ¡OF ¡CTC ¡EXPRESSING ¡ MESENCHYMAL ¡MARKERS ¡(N=47) ¡ ¡ MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016

5. ¡CLINICAL ¡TRIAL: ¡ASSOCIATION ¡OF ¡CD45 ¡NEG ¡SUBSETS ¡ WITH ¡CLINICOPATHOLOGICAL ¡FEATURES ¡ MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016

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5. ¡CLINICAL ¡STUDY: ¡ASSOCIATION ¡OF ¡CD45 ¡ NEG ¡SUBSETS ¡ WITH ¡CLINICAL ¡OUTCOME ¡ ¡AT ¡THE ¡DATABASE ¡LOCK: ¡ – Disease ¡progression : ¡29 ¡cases ¡ – Death : ¡18 ¡cases. ¡ ¡ – Median ¡follow-­‑up : ¡33 ¡months ¡ – Median ¡OS ¡from ¡CTC ¡assessment : ¡21.7 ¡months ¡ – Median ¡PFS ¡from ¡CTC ¡assessment ¡: ¡8.12 ¡months. ¡ ¡ – Es<mated ¡1-­‑year ¡and ¡2-­‑year ¡OS ¡rates : ¡70 ¡% ¡and ¡46 ¡%, ¡respecavely, ¡ – Es<mated ¡1-­‑year ¡and ¡2-­‑year ¡PFS ¡rates : ¡37 ¡% ¡and ¡19 ¡% ¡respecavely. ¡ MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016

Prof. ¡M. ¡Isola, ¡University ¡of ¡Udine ¡ MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016

MES ¡ EM-­‑CTC ¡ MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016

Conclusions MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016

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DEPArray™ User Meeting Ampli 1™ ¡LowPass ¡ CNA ¡analysis ¡on ¡single-­‑CTCs ¡obtained ¡by ¡ DEPArray™ ¡following ¡enrichment ¡by ¡depleaon ¡ ¡ n=6 ¡E-­‑CTC ¡ n=7 ¡EM-­‑CTC ¡ Paaent: ¡MAM-­‑26 ¡ n=7 ¡MES ¡ n=4 ¡NEG ¡ n=4 ¡LEUKOCYTES ¡ MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016