IDENTIFICATION OF FLUOROPHORES IN AQUATIC NATURAL DISSOLVED - PowerPoint PPT Presentation

3rd Student Workshop on Ecology and Optics of Coastal Zones 10 - 13 July 2017 Museum of the World Ocean, Kaliningrad, Russia 54°44'N 20°29'E IDENTIFICATION OF FLUOROPHORES IN AQUATIC NATURAL DISSOLVED ORGANIC MATTER Trubetskaya О.Е.* , Trubetskoj О.А. ** * Branch of Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Moscow region, Russia **Institute of Basic Biological Problems, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Moscow region, Russia

Suwannee River, Georgia, USA SRNOM international standard 1R101N С SRNOM =40 mg/L

SRNOM isolation by reverse osmosis

Scheme of experiment 1 step Aromatic amino Preparative SEC-PAGE fractionation, SRNOM acids: dialysis and lyophilization of fractions Tyrosine Tryptophan Fraction Fraction Fraction А В C+D 3D - excitation/emission matrix fluorescence 2 step analysis of fractions Analytical reversed-phase high-performance liquid 3 step chromatography with multi-wavelength fluorescence detection of retention times and emission spectra of humic-like and protein-like fluorophores Trubetskaya O.E., Richard C., Trubetskoj O.A. 2016. Environmental Chemistry Letters 14:495-500

Preparative SEC fractionation in 7M urea and analytical 1. electrophoresis in 10% PAG as testing system С+ D Electrophoresis in 10% PAG A 280 SEC on Sephadex G-75 column I II III IV V VI VII VIII IX X _ 0,4 1.5х100см A В В’ 0,2 А B C+D 0,0 I II III IV V VI VII VIII IX X 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 40 80 120 160 Elution volume, ml + A B C+D Dialysis through 10 kDa Fraction А - 4% cellulose tubes and lyophilization of fractions Fraction B - 10% Fraction C+D - 35% М S А > М S В > М S C+D>10kDa Organic matter with М S<10k Д a – 51% Трубецкой О.А., Трубецкая О.Е., Ришар К. 2009. Водные ресурсы 36:543 -550 Trubetskaya O.E., Richard C., Trubetskoj O.A. 2015. Environmental Science and Pollution Res. 14:495-500 Trubetskaya O.E., Richard C.,Voyard G., Marchenkov V.V.,Trubetskoj O.A. 2016. Desal. Water Treatm. 57:5358-5364

3D - excitation/emission matrix fluorescence 2. analysis of fractions A, B and C+D М S А > М S В > М S C+D>10k Д a А 270=0.05 a.u.

3D- и 2 D- fluorescence analysis of fractions A, B and C+D and selection of optimal conditions for RP-HPLC Fraction А SRNOM 2D-fluorescence spectra λех=270 нм, А270=0.05 a.u. 100 SRNOM SRNOM 80 Fluorescence intensity 60 C+D 40 A 20 B 0 350 400 450 500 550 600 650 700 Wavelength, nm Fraction В Fraction C+D 2,0 Absorbance spectra C+D С=50 mg/L 1,5 B Absorbance 1,0 SRNOM SRNOM 0,5 0,0 A 200 300 400 500 600 700 Wavelength, nm

Analytical reversed-phase high-performance 3. liquid chromatography with multi-wavelength fluorescence detection Humic-like fluorophores detection Fluorescence Fluorescence λ ex/ λ em = 270 nm/ 450 nm intensity intensity 250 30 1 Fraction А SRNOM 1 200 Protein-like fluorophores detection 20 150 λ ex/ λ em = 270 nm/ 330 nm 3a (4.9min) 4a (5.8min) 100 2 3 10 2 3 1a 4 50 4 (1.9min) 5 5 6 6 7 Fluorescence Tryptophan 0 intensity 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (5.8min) 1 100 30 60 Fraction В Fraction C+D 80 20 60 40 1 Tyrosine 40 (1.9min) 10 2 3 3a 2 3 20 4a 20 4 4 5 1a 5 6 6 7 0 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Retention time (min) Retention time (min) Retention time (min)

Fluorescence spectra of chromatographic peaks 1а, 3а, 4а and amino acids tyrosine and tryptophan from the data of multi-wavelength fluorescence detector at λ ex = 270 nm, λ em = 290-580 nm Fluorescence Fluorescence intensity intensity 120 Tryptophan Tyrosine 90 90 60 Peak 1а Peak 3а 60 30 30 0 0 Peak 4а 300 350 400 450 300 350 400 450 Wavelength, nm Wavelength, nm Retention time : Tyrosine - 1.9 min Tryptophan - 5.8 min Peak 1а - 1.9 min Peak 4а - 5.8 min Peak 3а - 4.9 min

CONCLUSIONS • Himic-like fluorescence of SRNOM is caused by the sum of several fluorophores having different emission maxima - hydrophilic with λ = 435 nm and several hydrophobic ones with λ = 450 -465 nm • About 50% of the protein-like fluorescence of SRNOM is due to the presence of free amino acids of tyrosine and tryptophan in the fractions of the largest and average molecular size • The detection of free amino acids in the aquatic NOM is extremely important for understanding the role of DOM as a natural archive of amino acids and potential source of structural components for protein synthesis as the basis of life.

Sandro Botticelli "The Birth of Venus" 1482-1486

The work has been supported by: • COBASE, USA • Russian Foundation for Basic Research 13-05-00241 and 15-04- 00525 • International project №12 between CNRS (France) – RAS(Russia)

Спектры флуоресценции хроматографических пиков по данным мультиволнового детектора флуоресценции, настроенного на λвоз = 270нм, λисп = 290 - 580 нм Интенсивность 1. Гуминоподобный Интенсивность флуоресценции гидрофильный флуоресценции СуРОВ Фракция А флуорофор (пик 1) – 250 1 25 λмакс = 435 нм 1 1a 200 20 2. Гуминоподобные 3a 150 гидрофобные 15 4a флуорофоры (пики 2 -7) 100 3 10 λмакс = 450 - 465 нм 2 2-3 4 50 5 5 4 3. Белковоподобные 0 0 1a 6-7 6 5 флуорофоры (пики 2 -7) 300 350 400 450 300 350 400 450 λмакс = 350 нм 4. Свободные Фракция C+D 1 Фракция В 100 25 аминокислоты 80 20 тирозин (пик 1а) с 1 60 15 λмакс = 300 нм, время выхода с колонки – 40 10 1a 2-3 4a 1.9мин 2 3a 20 5 4 3 5 4 триптофан (пик 4а) 0 0 5 6 1a 6-7 λмакс = 350 нм, время 300 350 400 450 300 350 400 450 выхода с колонки – Длина волны (нм) Длина волны (нм) 5.8мин

3D- флуоресцентные диаграммы РОВ трех водных источников различного генезиса и географического положения А270=0.05 о.е. Река Сувани Онежское озеро Водопроводное озеро Джорджия, США Карелия, Россия Карелия, Россия Emission wavelength, nm Emission wavelength, nm Emission wavelength, nm

• Важнейшим свойством и отличительной чертой класса ГВ от биологических молекул является их устойчивость к разложению микроорганизмами и другими абиотическими факторами • ГВ проявляют ярко выраженные поверхностно - активные свойства • ГВ образуют коллоидные растворы со средним минимальным диаметром частиц от 90 до 200 Ǻ

Концентрация кислород - содержащих функциональных групп в составе средней ГВ Функциональные Мг - экв/грамм группы СООН 4,5 Фенольные ОН 2,1 Спиртовые ОН 2,8 Хиноидные С=О 2,5 Кетонные С=О 1,9 ОСН 3 0,3 M. Schnitzer, 1991, Soil Science

Гипотетические модели строения гуминовых веществ Макромолекулярная модель Супрамолекулярная модель Wershaw, 1986 Kleinhempel, 1970 Piccolo, 1997 Hutta et al., J.Chromatography, 2011

Твердофазный 13 C- ЯМР ГК чернозема и фракций A, B и C+D HA HAU A B C+D 300 250 200 150 100 50 0 ppm Trubetskoj O. А. , Hatcher P.G., Trubetskaya O.E. 2010, Chemistry and Ecology 26, 315-325