Genome-wide approaches to study alterna5ve splicing using - PowerPoint PPT Presentation

Genome-­‑wide ¡approaches ¡to ¡study ¡ alterna5ve ¡splicing ¡using ¡RNA-­‑seq ¡data ¡ Kathi ¡Zarnack ¡ zarnack@ebi.ac.uk ¡ Cambridge, ¡06/02/2013 ¡

Introducing ¡myself ¡ postdoc ¡at ¡the ¡CRUK ¡London ¡Research ¡Ins5tute ¡in ¡the ¡group ¡of ¡ Prof. ¡Nick ¡Luscombe ¡( hPp://www.luscombelab.org ) ¡ ¡ ¡ ¡ PhD ¡in ¡ Molecular ¡Microbiology ¡ switch ¡to ¡ Bioinforma8cs ¡for ¡my ¡postdoc ¡ ¡ interested ¡in ¡ pos:ranscrip8onal ¡regula8on ¡and ¡the ¡ac5on ¡of ¡ RNA-­‑binding ¡proteins ¡

Outline ¡of ¡this ¡lecture ¡ • Introduc5on: ¡ – Alterna5ve ¡splicing ¡(AS) ¡ – Global ¡iden5fica5on ¡of ¡AS ¡events ¡ • Focus ¡of ¡this ¡Review: ¡ – Major ¡challenges ¡ – Different ¡approaches ¡to ¡extract ¡AS ¡ events ¡from ¡RNA-­‑seq ¡data ¡ – Applica5ons ¡ • Conclusions ¡ ¡

INTRODUCTION ¡I ¡ Alterna5ve ¡Splicing ¡(AS) ¡

The ¡complex ¡life ¡of ¡mRNA ¡ McKee ¡and ¡SIlver ¡(2007) ¡ Cell ¡Res ¡17, ¡581-­‑90 ¡

Alterna5ve ¡splicing ¡(AS) ¡ Image ¡taken ¡from ¡hPp://as-­‑alps.nagahama-­‑i-­‑bio.ac.jp/ ¡

Example ¡I: ¡Dscam ¡in ¡ Drosophila ¡ • ¡neuronal ¡cell-­‑surface ¡receptor ¡ • ¡more ¡than ¡38,000 ¡different ¡isoforms ¡ • ¡homophilic ¡interac5ons ¡mediate ¡repulsion ¡of ¡axons ¡and ¡dendrites ¡ Zipursky ¡et ¡al. ¡(2006) ¡Trends ¡Biochem ¡Sci ¡10:581-­‑8; ¡Hemani ¡and ¡Soller ¡(2012) ¡Biochem ¡Soc ¡Trans ¡40: ¡804-­‑9 ¡

Example ¡2: ¡Developmental ¡switch ¡ Gabut ¡et ¡al. ¡(2011) ¡Cell ¡147, ¡132-­‑146 ¡

Types ¡of ¡alterna5ve ¡splicing ¡events ¡ Cassette exon Mutually exclusive exons Retained intron Alternative 5’splice sites Alternative 3’splice sites Alternative promoters Alternative poly-A sites Picture ¡taken ¡from ¡Lu ¡et ¡al. ¡(2011) ¡Handbook ¡on ¡Sta5s5cal ¡Bioinforma5cs, ¡Springer ¡Verlag ¡Berlin ¡Heidelberg ¡

The ¡regula5on ¡of ¡AS ¡events ¡ spliceosome ¡ large ¡ribonucleoprotein ¡complexes ¡ a ¡mul5tude ¡of ¡addi5onal ¡ (U1/U2/U4-­‑U5-­‑U6 ¡snRNPs) ¡ trans -­‑ac5ng ¡ splicing ¡regulators ¡ interplay ¡determines ¡the ¡ splicing ¡decision ¡ at ¡each ¡individual ¡exon ¡ Chen ¡and ¡Manley ¡(2009) ¡Nat ¡Rev ¡Mol ¡Cell ¡Biol ¡10, ¡741-­‑54 ¡

Misregula5on ¡in ¡disease ¡ A ¡large ¡number ¡of ¡disease ¡are ¡associated ¡with ¡muta5ons ¡ in ¡RNA-­‑binding ¡proteins ¡ ¡ -­‑ ¡FMRP ¡(Fragile ¡X ¡Mental ¡Retarda5on ¡Protein; ¡associated ¡ with ¡Fragile ¡X ¡Syndrome) ¡ -­‑ ¡SMN ¡(Survival ¡Motor ¡Neuron ¡Protein; ¡mutated ¡in ¡Spinal ¡ Muscular ¡Atrophy) ¡ -­‑ ¡TDP-­‑43 ¡(associated ¡with ¡familial ¡form ¡of ¡Amyotrophic ¡ Lateral ¡Sclerosis) ¡ -­‑ ¡FUS ¡(Fused ¡in ¡Sarcoma; ¡associated ¡also ¡with ¡ALS ¡and ¡ FTLD) ¡

AS ¡as ¡therapeu5c ¡targets ¡ Singh ¡and ¡Cooper ¡(20012) ¡Trends ¡Mol ¡Med ¡18, ¡472-­‑82. ¡

INTRODUCTION ¡II ¡ Global ¡iden5fica5on ¡of ¡AS ¡ events ¡

Expressed ¡sequence ¡tags ¡(ESTs) ¡ • ¡cloning ¡and ¡sequencing ¡of ¡large ¡cDNA ¡fragments ¡(300-­‑400 ¡nt) ¡ • ¡genomic ¡alignment ¡with ¡special ¡tools, ¡eg. ¡BLAT 1 ¡(BLAST-­‑like ¡ Alignment ¡Tool) ¡ • ¡some ¡aligner ¡take ¡into ¡consider ¡consensus ¡splice ¡sites, ¡eg. ¡ GMAP 2 ¡ 1 Kent ¡(2002) ¡Genome ¡Res ¡12: ¡656-­‑64. ¡ 2 Wu ¡and ¡Watanabe ¡(2005) ¡Bioinforma5cs ¡21: ¡1859-­‑75. ¡

Microarrays ¡ Splice-­‑junc8on ¡arrays ¡ Exon ¡arrays ¡ reciprocal ¡behaviour ¡of ¡probes ¡ reciprocal ¡behaviour ¡of ¡probes ¡ that ¡measure ¡inclusion ¡and ¡ that ¡measure ¡inclusion ¡and ¡ exclusion ¡of ¡the ¡exon ¡ exclusion ¡of ¡the ¡exon ¡

High-­‑throughput ¡RNA ¡sequencing ¡ Image ¡taken ¡from ¡cmb.molgen.mpg.de ¡

Different ¡types ¡of ¡RNA-­‑seq ¡ Different ¡sequencing ¡technologies: ¡ • ¡ ¡varying ¡read ¡lengths ¡ • ¡ ¡different ¡error ¡rates ¡ Illumina ¡HiSeq ¡ Different ¡experimental ¡protocols: ¡ stranded ¡vs. ¡unstranded ¡libraries ¡ • single-­‑end ¡(SE) ¡vs. ¡paired-­‑end ¡(PE) ¡ • ABI ¡DNA ¡Analyzer ¡

FOCUS ¡OF ¡THIS ¡REVIEW ¡

Focus ¡of ¡this ¡review ¡ “In ¡theory, ¡RNA-­‑seq ¡can ¡be ¡used ¡to ¡build ¡a ¡complete ¡map ¡of ¡the ¡ transcriptome ¡across ¡all ¡cell ¡types, ¡pertuba5ons ¡and ¡states. ¡To ¡fully ¡realize ¡ this ¡goal, ¡however, ¡RNA-­‑seq ¡requires ¡powerful ¡computa5onal ¡tools.” ¡ Garber ¡et ¡al. ¡(2011) ¡Computa5onal ¡methods ¡for ¡transcriptome ¡annota5on ¡and ¡quan5fica5on ¡ using ¡RNA-­‑seq. ¡Nat ¡Methods ¡8: ¡469-­‑77. ¡ Here, ¡I ¡will ¡review ¡computa5onal ¡approaches ¡to ¡extract ¡ alterna5ve ¡splicing ¡informa5on ¡from ¡RNA-­‑seq ¡data. ¡ In ¡par5cular, ¡I ¡will ¡ • ¡explain ¡the ¡ major ¡challenges ¡ • ¡introduce ¡the ¡ different ¡solu8ons ¡and ¡how ¡they ¡were ¡ implemented ¡in ¡various ¡ available ¡tools ¡ • ¡discuss ¡their ¡ benefits ¡for ¡addressing ¡different ¡biological ¡ ques5ons ¡ ¡ ¡

The ¡goal ¡ 1. Genomic ¡alignment ¡ (con5nuous ¡or ¡splice-­‑aware) ¡ 2. Transcript ¡reconstruc5on ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ (or ¡use ¡known ¡annota5on) ¡ 3. Quan5fica5on ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ (gene-­‑level ¡or ¡transcript-­‑level) ¡ Haas ¡and ¡Zody ¡(2010) ¡Nat ¡Biotechnol ¡28: ¡421-­‑3 ¡

Genomic ¡alignment ¡ Splice-­‑aware ¡alignment ¡tools: ¡TopHat 1 , ¡SpliceMap 2 , ¡GSNAP 3 , ¡QPALMA 4 ¡ 1 Wang ¡et ¡al. ¡(2008) ¡Nature ¡456: ¡470-­‑6; ¡ ¡ 3 Robertson ¡et ¡al. ¡(2010) ¡Nat ¡Methods ¡7: ¡909-­‑12. ¡ 2 Wu ¡and ¡Nacu ¡(2010) ¡Bioinforma5cs ¡26: ¡873-­‑81. ¡ 4 Birol ¡et ¡al. ¡(2009) ¡Bioinforma5cs ¡25: ¡2872-­‑77. ¡

Transcript ¡reconstruc5on ¡ Cufflinks 1 : ¡minimal ¡set ¡of ¡ compa5ble ¡isoforms ¡(maximum ¡ precision) ¡ ¡ Scripture 2 : ¡all ¡isoforms ¡that ¡are ¡ compa5ble ¡with ¡the ¡read ¡data ¡ (maximum ¡sensi5vity) ¡ 1 Trapnell ¡et ¡al. ¡(2010) ¡Nat ¡Biotechnol ¡28: ¡511-­‑15 ¡ 2 GuPman ¡et ¡al. ¡(2010) ¡Nat ¡Biotechnol ¡28: ¡503-­‑10 ¡

Novel ¡transcript ¡structures ¡ GuPman ¡et ¡al. ¡(2010) ¡ Nat ¡Biotechnol ¡28: ¡503-­‑10 ¡

Quan5fying ¡transcript ¡abundance ¡ Challenges: ¡ 1. millions ¡of ¡reads ¡ 2. most ¡reads ¡cannot ¡be ¡mapped ¡unequivocally ¡to ¡a ¡single ¡ transcript ¡isoform ¡ 3. discriminate ¡gene-­‑level ¡from ¡transcript-­‑level ¡changes ¡in ¡ expression ¡ 4. exon-­‑centric ¡vs. ¡transcript-­‑centric ¡view ¡of ¡alterna5ve ¡splicing ¡

DIFFERENT ¡APPROACHES ¡