Sample ¡requirements ¡ Sample ¡volume ¡ • • SV ¡ • 360 ¡µl ¡(up ¡to ¡480 ¡µl) ¡in ¡12 ¡mm ¡pathlength ¡ • 90 ¡µl ¡(up ¡to ¡120 ¡µl) ¡in ¡3 ¡mm ¡pathlength ¡ • SE ¡ • 20 ¡µl ¡(8-‑channel ¡centrepiece ¡-‑ ¡interference ¡op&cs ¡only) ¡ • 80 ¡µl ¡(2-‑ ¡or ¡6-‑channel ¡centrepiece) ¡ Sample ¡concentra&on ¡ • • Absorbance ¡op&cs: ¡A λ ≈ ¡0.1-‑1.0 ¡in ¡12 ¡mm ¡pathlength ¡cell ¡ ¡ • λ ¡= ¡180-‑800 ¡nm ¡ • Interference ¡op&cs: ¡typically ¡0.05-‑30 ¡mg/ml ¡ Sample ¡reference ¡ • • Absorbance ¡op&cs: ¡can ¡be ¡column ¡eluant ¡or ¡dialysate ¡beper ¡ ¡ • Interference ¡op&cs: ¡must ¡be ¡dialysate ¡ Typical ¡mul&plexing: ¡3 ¡or ¡7 ¡sample ¡holders ¡(“cells”)/run ¡ •
Structure ¡of ¡this ¡session ¡ Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡ • Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡ • AUC ¡instrumenta&on ¡ • Modes ¡of ¡opera&on ¡ • Some ¡theory ¡ • SE ¡ versus ¡SV ¡ • Data ¡analysis ¡ • Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡ • Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡ • Some ¡theory ¡ • SoOware ¡ • HYDRO++ ¡ • • Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α 5 β 1 ¡ligands ¡ HYDROPRO ¡ • SOMO ¡ • • Example: ¡Tpx ¡ ¡
In ¡the ¡AUC ¡there ¡are ¡3 ¡forces ¡on ¡a ¡molecule ¡ direc&on ¡of ¡ rotor ¡ buoyant ¡ centrifugal ¡ r ¡ m ¡ fric&onal ¡ ω ¡(radians/s) ¡ ¡ ¡ 1 ¡revolu&on ¡= ¡ 2 π ¡radians ¡= ¡ 6.28 ¡radians ¡ ¡
1: ¡Centrifugal ¡force ¡ r = M r = M r = M c = m ! 2 c = m ! 2 c = m ! 2 ! 2 r ! 2 r ! 2 r F F F N A N A N A centrifugal ¡ r ¡ m ¡
2: ¡Buoyancy ¡force ¡ b = ! m 0 " 2 r = ! M b = ! m 0 " 2 r = M b = ! m 0 " 2 r = ! M #" 2 r #" 2 r #" 2 r F v F F v v N A N A N A mass ¡= ¡volume ¡x ¡density mass ¡= ¡volume ¡x ¡density mass ¡= ¡volume ¡x ¡density ¡ ¡ ¡ buoyant ¡ r ¡ m ¡ m 0 ¡ M = ¡ ! x ¡ v N A displaces ¡
3: ¡Fric&onal ¡force ¡ r ¡ m ¡ fric&onal ¡ F f = ! fu fric&onal ¡coefficient ¡ speed ¡of ¡molecule ¡
3 ¡forces ¡balance ¡rapidly ¡ In ¡< ¡1 ¡µs ¡ F c + F b + F f = 0 buoyant ¡ centrifugal ¡ r ¡ m ¡ fric&onal ¡
3 ¡forces ¡balance ¡rapidly ¡ In ¡< ¡1 ¡µs ¡ F c + F b + F f = 0 M ! M ! 2 r "# 2 r v ! fu =0 ¡ N A N A M ) # 2 ! fu = 0 ( 1 ! v " N A u = M( 1 " v # ) sedimenta&on ¡ ! 2 r N A f coefficient ¡
2 ¡important ¡equa&ons ¡ " = # = &'( # )! $ * " $ % + , - !! #$% " = Svedberg ¡equa&on ¡ &'( " )! # * !!
SV: ¡diffusion ¡opposes ¡a ¡concentra&on ¡gradient ¡ absorbance ¡ t=0 ¡ Diffusion ¡is ¡inversely ¡ • radius ¡ ! = "# dependent ¡on ¡fric&onal ¡ $ % & coefficient ¡ Fick’s ¡1 st ¡law: ¡diffusional ¡ • t=1 ¡h ¡ flow ¡(flux) ¡is ¡propor&onal ¡to ¡ ! = ! " " # diffusion ¡coefficient ¡and ¡ " $ concentra&on ¡gradient ¡ Fick’s ¡2 nd ¡law: ¡rate ¡of ¡ • change ¡of ¡concentra&on ¡is ¡ t=3 ¡h ¡ = # ! $ ! ! ! propor&onal ¡to ¡change ¡in ¡ ! " ! % $ steepness ¡of ¡concentra&on ¡ gradient ¡
Transport ¡ versus ¡equilibrium ¡ Transport ¡(e.g. ¡SV) ¡ • " % " % ! ! = ( $ % ) & # & ! ( '# ! ! ! $ ' $ ' ! " # ! # ! # # & # & # " sedimenta&on ¡ diffusion ¡ Equilibrium ¡(e.g. ¡SE) ¡ • ! = " ! # $% " & # % = ' # $
Structure ¡of ¡this ¡session ¡ Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡ • Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡ • AUC ¡instrumenta&on ¡ • Modes ¡of ¡opera&on ¡ • Some ¡theory ¡ • SE ¡ versus ¡SV ¡ • Data ¡analysis ¡ • Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡ • Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡ • Some ¡theory ¡ • SoOware ¡ • HYDRO++ ¡ • • Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α 5 β 1 ¡ligands ¡ HYDROPRO ¡ • SOMO ¡ • • Example: ¡Tpx ¡ ¡
SV ¡ versus ¡SE ¡ In ¡SV ¡we ¡observe ¡the ¡movement ¡of ¡a ¡sedimenta&on ¡boundary ¡ • The ¡change ¡in ¡the ¡(some&mes ¡complex) ¡boundary ¡over ¡&me ¡is ¡due ¡to ¡ • Sedimenta&on ¡ • Diffusion ¡ • In ¡SE ¡the ¡rotor ¡is ¡spun ¡more ¡slowly ¡so ¡that ¡diffusion ¡can ¡balance ¡ • sedimenta&on ¡and ¡the ¡system ¡reaches ¡thermodynamic ¡equilibrium ¡ Then ¡we ¡observe ¡no ¡change ¡in ¡the ¡boundary ¡over ¡&me ¡ • Unless ¡the ¡sample ¡is ¡degrading ¡or ¡changing ¡in ¡some ¡other ¡way ¡ •
SV: ¡radial ¡movement ¡recorded ¡as ¡func&on ¡of ¡&me ¡
SV: ¡species ¡can ¡resolve ¡into ¡separate ¡boundaries ¡
SE: ¡6-‑hole ¡centrepiece ¡data ¡recorded ¡un&l ¡no ¡change ¡
Self-‑associa&on: ¡“deconvolu&on” ¡into ¡individual ¡ components ¡ experimental ¡data ¡= ¡ tetramer ¡ sum ¡of ¡species ¡ dimer ¡ monomer ¡
SE ¡data: ¡the ¡sum ¡of ¡exponen&als ¡for ¡self-‑associa&on ¡ ! " = #$%&'(! ) + *+,-" . ! " ) monomer ¡ . /0 + #$%&( . '(! ) + '(12 . + ( . +*+,-" . ! " ) . /0 1-‑n 2 ¡ + #$%&( 3 '(! ) + '(12 3 + ( 3 +*+,-" . ! " ) 1-‑n 3 ¡ . /0 + #$%&( 4 '(! ) + '(12 4 + ( 4 +*+,-" . ! " ) . /0 + 5 1-‑n 2 ¡
SE: ¡best ¡model ¡revealed ¡by ¡residuals ¡ 2-‑4 ¡ 1-‑4 ¡ 0.040 0.080 0.020 0.040 residuals residuals 0.000 0.000 -0.020 -0.040 -0.040 -0.080 1.20 1.20 1.00 1.00 absorbance absorbance 0.80 0.80 0.60 0.60 0.40 0.40 0.20 0.20 5.95 6.05 6.15 5.95 6.05 6.15 radius (cm) radius (cm)
Structure ¡of ¡this ¡session ¡ Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡ • Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡ • AUC ¡instrumenta&on ¡ • Modes ¡of ¡opera&on ¡ • Some ¡theory ¡ • SE ¡ versus ¡SV ¡ • Data ¡analysis ¡ • Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡ • Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡ • Some ¡theory ¡ • SoOware ¡ • HYDRO++ ¡ • • Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α 5 β 1 ¡ligands ¡ HYDROPRO ¡ • SOMO ¡ • • Example: ¡Tpx ¡ ¡
Many ¡methods ¡& ¡programs ¡for ¡SV ¡data ¡analysis ¡ Too ¡many ¡for ¡comprehensive ¡review ¡here. ¡ • Model ¡independent: ¡ • dC/dt ¡(Stafford, ¡SedAnal) ¡ • Eliminates ¡&me ¡invariant ¡noise. ¡Resultant ¡curves ¡can ¡be ¡fiped ¡with ¡Gaussians ¡to ¡reveal ¡ • species ¡content ¡and ¡sedimenta&on ¡coefficients. ¡ c(s) ¡(Schuck, ¡Sedfit) ¡ • Good ¡for ¡“first ¡look” ¡at ¡data ¡to ¡get ¡an ¡idea ¡of ¡number ¡of ¡species. ¡ ¡Not ¡a ¡proper ¡fit ¡to ¡data. ¡ ¡ • van ¡Holde-‑Weischet ¡(Demeler, ¡UltraScan ¡II) ¡ • Diffusion ¡corrected ¡s ¡distribu&on. ¡ ¡Good ¡for ¡detec&on ¡of ¡aggregates ¡and ¡iden&fica&on ¡of ¡ • underlying ¡model. ¡ Model ¡dependent: ¡ • Non-‑interac&ng ¡discrete ¡species ¡(Schuck, ¡Sedfit) ¡ • Up ¡to ¡4 ¡separate ¡species ¡can ¡be ¡fiped. ¡ • Self-‑associa&on ¡(Stafford, ¡SedAnal; ¡Demeler, ¡UltraScan ¡II) ¡ • Determina&on ¡of ¡K d , ¡k on , ¡k off , ¡stoichiometry ¡ •
Almost ¡all ¡AUC ¡data ¡analysis ¡soOware ¡is ¡freely ¡available ¡ The ¡RASMB ¡website ¡ ¡ • “Reversible ¡Associa&ons ¡in ¡Structural ¡and ¡Molecular ¡Biology” ¡ • hpp://www.rasmb.bbri.org/ ¡ • Access ¡to ¡freely ¡available ¡soOware ¡ • Subscrip&on ¡to ¡AUC-‑related ¡discussion ¡group ¡ • Schuck ¡lab ¡(SEDFIT, ¡SEDPHAT) ¡ • hpp://www.analy&calultracentrifuga&on.com/default.htm ¡ • Demeler ¡lab ¡(UltraScan ¡II ¡(including ¡SOMO)) ¡ • hpp://www.ultrascan.uthscsa.edu/ ¡ •
SEDNTERP: ¡Calcula&on ¡of ¡ ρ , ¡ η ¡and ¡par&al ¡specific ¡volume ¡ ¡ ¡ hpp://www.rasmb.bbri.org/soOware/PC/sednterp-‑philo/ ¡
M ¡and ¡psv ¡computed ¡from ¡amino ¡acid ¡sequence ¡ ¡ hpp://www.rasmb.bbri.org/soOware/PC/sednterp-‑philo/ ¡
ρ , ¡ η ¡computed ¡from ¡cons&tuents ¡ ¡ hpp://www.rasmb.bbri.org/soOware/PC/sednterp-‑philo/ ¡
Final ¡complete ¡set ¡of ¡parameters ¡for ¡subsequent ¡SV ¡& ¡SE ¡ data ¡analysis ¡ ¡ ¡ hpp://www.rasmb.bbri.org/soOware/PC/sednterp-‑philo/ ¡
c(s) ¡analysis: ¡how ¡many ¡species ¡+ ¡s ¡of ¡species ¡ 1: ¡Load ¡SV ¡data ¡ ¡ hpp://www.analy&calultracentrifuga&on.com/default.htm ¡
2: ¡Specify ¡parameters ¡ ¡ hpp://www.analy&calultracentrifuga&on.com/default.htm ¡
3: ¡Set ¡meniscus, ¡cell ¡base ¡and ¡analysis ¡limits ¡ ¡ hpp://www.analy&calultracentrifuga&on.com/default.htm ¡
4: ¡Run ¡ ¡ hpp://www.analy&calultracentrifuga&on.com/default.htm ¡
5: ¡Subtract ¡&me ¡and ¡radial ¡invariant ¡noise ¡ ¡ hpp://www.analy&calultracentrifuga&on.com/default.htm ¡
6: ¡Fit ¡(with ¡solu&ons ¡to ¡the ¡Lamm ¡equa&on) ¡ ¡ hpp://www.analy&calultracentrifuga&on.com/default.htm ¡
7: ¡Integrate ¡to ¡obtain ¡es&mate ¡of ¡concentra&on ¡of ¡species ¡ and ¡weight-‑average ¡values ¡ ¡ hpp://www.analy&calultracentrifuga&on.com/default.htm ¡
Non-‑interac&ng ¡discrete ¡species ¡model ¡(NIDS) ¡ ¡ hpp://www.analy&calultracentrifuga&on.com/default.htm ¡
NIDS ¡provides ¡a ¡fit ¡to ¡the ¡data ¡with ¡a ¡defined ¡model ¡ ¡ hpp://www.analy&calultracentrifuga&on.com/default.htm ¡
Tpx ¡example ¡ Give ¡brief ¡biology ¡background ¡ • Give ¡stats ¡– ¡mol ¡weight, ¡sequence, ¡mx ¡structure ¡– ¡but ¡not ¡N-‑term ¡36 ¡a.a. ¡ • SV ¡data ¡for ¡tpx ¡alone ¡– ¡dimer ¡ • SOMO ¡modelling ¡ • SE ¡data ¡for ¡tpx ¡alone ¡– ¡dimer ¡ • Drug ¡binding ¡– ¡ME0055 ¡observed ¡at ¡its ¡lambda ¡ • Gave ¡stoichiometry ¡& ¡Kd ¡ • Have ¡also ¡done ¡SAXS ¡– ¡consistent ¡with ¡hydrodynamics ¡ •
PhtD ¡ Give ¡brief ¡biology ¡background ¡ • Give ¡stats ¡– ¡mol ¡weight, ¡sequence, ¡no ¡structure ¡ • I-‑TASSER ¡ • SV ¡data ¡for ¡PhtD ¡alone ¡– ¡monomer ¡ • SOMO ¡modelling ¡of ¡I-‑TASSER ¡ • SE ¡data ¡for ¡PhtD ¡alone ¡– ¡monomer ¡ • SAXS ¡just ¡done ¡ •
YgaU ¡ Give ¡brief ¡biology ¡background ¡ • Give ¡stats ¡– ¡mol ¡weight, ¡sequence, ¡NMR ¡structure ¡– ¡± ¡K+? ¡ • SV ¡data ¡for ¡YgaU ¡± ¡K+ ¡alone ¡– ¡monomer, ¡but ¡different ¡s ¡ • SOMO ¡modelling ¡ • SE ¡data ¡– ¡monomer ¡ • SAXS ¡just ¡done ¡ •
Structure ¡of ¡this ¡session ¡ Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡ • Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡ • AUC ¡instrumenta&on ¡ • Modes ¡of ¡opera&on ¡ • Some ¡theory ¡ • SE ¡ versus ¡SV ¡ • Data ¡analysis ¡ • Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡ • Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡ • Some ¡theory ¡ • SoOware ¡ • HYDRO++ ¡ • • Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α 5 β 1 ¡ligands ¡ HYDROPRO ¡ • SOMO ¡ • • Example: ¡Tpx ¡ ¡
Structure ¡of ¡this ¡session ¡ Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡ • Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡ • AUC ¡instrumenta&on ¡ • Modes ¡of ¡opera&on ¡ • Some ¡theory ¡ • SE ¡ versus ¡SV ¡ • Data ¡analysis ¡ • Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡ • Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡ • Some ¡theory ¡ • SoOware ¡ • HYDRO++ ¡ • • Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α 5 β 1 ¡ligands ¡ HYDROPRO ¡ • SOMO ¡ • • Example: ¡Tpx ¡ ¡
s: ¡inversely ¡related ¡to ¡fric&onal ¡coe• ¡ " = #$% " &! # ' ( ) * !! M, ¡f 0 ¡ M, ¡f>f 0 ¡ M, ¡f>f 0 ¡
s ¡= ¡devia&on ¡from ¡sphericity ¡+ ¡hydrodynamic ¡hydra&on ¡ " = #$% " &! # ' ( ) * !! M, ¡f 0 ¡ M, ¡f>f 0 ¡ M, ¡f>f 0 ¡ M, ¡f>>f 0 ¡
Fric&on ¡= ¡Asymmetry ¡+ ¡Hydra&on ¡ % ' " % $ ! " = ! # M, ¡V h , ¡s, ¡f ¡ ¡ $ ' $ ' & $ + ! $ % # & ! " = #$ ! " = #$ = ' ( ! ) * M, ¡V a , ¡s a , ¡f a ¡ ¡ % & % & ( M, ¡V a , ¡s 0 , ¡f 0 ¡ ¡ ! " = # !" $ "
Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡(HBM) ¡ s = ? S
Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡ Fric&onal ¡proper&es ¡of ¡sphere ¡and ¡assemblies ¡of ¡spheres ¡exactly ¡known ¡ • s ¡for ¡molecule ¡represented ¡as ¡sphere ¡assembly ¡(bead ¡model) ¡can ¡be ¡ • accurately ¡computed ¡ If ¡s comp ¡≈ ¡s exp ¡model ¡is ¡ one ¡plausible ¡solu&on ¡conforma&on ¡for ¡the ¡molecule ¡ • For ¡one ¡sphere ¡ ! " = # !" $ " • For ¡an ¡assembly ¡of ¡spheres ¡an ¡approximate ¡solu&on ¡is ¡ ¡ • where ¡ ¡ •
Structure ¡of ¡this ¡session ¡ Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡ • Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡ • AUC ¡instrumenta&on ¡ • Modes ¡of ¡opera&on ¡ • Some ¡theory ¡ • SE ¡ versus ¡SV ¡ • Data ¡analysis ¡ • Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡ • Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡ • Some ¡theory ¡ • SoOware ¡ • HYDRO++ ¡ • • Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α 5 β 1 ¡ligands ¡ HYDROPRO ¡ • SOMO ¡ • • Example: ¡Tpx ¡ ¡
Several ¡freely ¡available ¡programs ¡for ¡HBM ¡ A ¡more ¡exact ¡expression ¡for ¡f t ¡together ¡with ¡expressions ¡for ¡other ¡ • hydrodynamic ¡and ¡related ¡parameters ¡are ¡encoded ¡in ¡HBM ¡soOware ¡ ¡ From ¡the ¡group ¡of ¡José ¡García ¡de ¡la ¡Torre ¡(Universidad ¡Murcia, ¡Spain) ¡ • hpp://leonardo.inf.um.es/macromol/programs/programs.htm ¡ • HYDRO ¡ • • Computes ¡hydrodynamic ¡& ¡other ¡parameters ¡for ¡any ¡bead ¡model ¡ HYDROPRO ¡ • • Computes ¡hydrodynamic ¡& ¡other ¡parameters ¡for ¡models ¡constructed ¡from ¡pdb ¡files ¡ And ¡many ¡other ¡programs…. ¡ • From ¡a ¡collabora&on ¡between ¡Ma„a ¡Rocco, ¡Emre ¡Brookes, ¡Borries ¡Demeler ¡& ¡ • Olwyn ¡Byron ¡ hpp://www.ultrascan.uthscsa.edu/SOMO ¡ • • Generates ¡HBMs ¡from ¡pdb ¡files, ¡computes ¡hydrodynamic ¡& ¡other ¡parameters ¡with ¡ ¡ realis&c ¡hydra&on ¡ Reviewed ¡in ¡Byron ¡(2008) ¡Methods ¡in ¡Cell ¡Biology ¡84 ¡327-‑373 ¡
Parameters ¡that ¡can ¡be ¡computed ¡(1/4) ¡
Parameters ¡that ¡can ¡be ¡computed ¡(2/4) ¡
Parameters ¡that ¡can ¡be ¡computed ¡(3/4) ¡
Parameters ¡that ¡can ¡be ¡computed ¡(4/4) ¡
Structure ¡of ¡this ¡session ¡ Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡ • Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡ • AUC ¡instrumenta&on ¡ • Modes ¡of ¡opera&on ¡ • Some ¡theory ¡ • SE ¡ versus ¡SV ¡ • Data ¡analysis ¡ • Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡ • Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡ • Some ¡theory ¡ • SoOware ¡ • HYDRO++ ¡ • • Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α 5 β 1 ¡ligands ¡ HYDROPRO ¡ • SOMO ¡ • • Example: ¡Tpx ¡ ¡
HYDRO++ ¡input ¡is ¡bead ¡coordinates ¡plus ¡“control” ¡file ¡ ¡ García ¡de ¡la ¡Torre ¡ et ¡al . ¡1994 ¡Biophys ¡J. ¡67 ¡530-‑531 ¡
HYDRO++ ¡runs ¡in ¡DOS ¡window ¡ ¡ hpp://leonardo.inf.um.es/macromol/programs/hydro++/hydro++.htm ¡
Output ¡is ¡hydrodynamic ¡+ ¡other ¡parameters ¡ ¡ (data ¡cropped) ¡ ¡ (data ¡cropped) ¡ hpp://leonardo.inf.um.es/macromol/programs/hydro++/hydro++.htm ¡
Bead ¡model ¡can ¡be ¡viewed ¡in ¡vrml ¡viewer ¡ ¡ hpp://leonardo.inf.um.es/macromol/programs/hydro++/hydro++.htm ¡
Structure ¡of ¡this ¡session ¡ Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡ • Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡ • AUC ¡instrumenta&on ¡ • Modes ¡of ¡opera&on ¡ • Some ¡theory ¡ • SE ¡ versus ¡SV ¡ • Data ¡analysis ¡ • Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡ • Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡ • Some ¡theory ¡ • SoOware ¡ • HYDRO++ ¡ • • Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α 5 β 1 ¡ligands ¡ HYDROPRO ¡ • SOMO ¡ • • Example: ¡Tpx ¡ ¡
Oligomerisa&on ¡of ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α 5 β 1 ¡ ligands ¡ α 5 β 1 ¡used ¡to ¡immobilise ¡cells ¡on ¡surfaces ¡via ¡ • 9 th ¡type ¡III ¡FN ¡domain ¡synergy ¡site ¡(PHSRN) ¡ • 10 th ¡type ¡III ¡FN ¡domain ¡RGD ¡site ¡ • α 5 β 1 ¡ oligomers ¡facilitate ¡increased ¡binding ¡ • Oligomerisa&on ¡accomplished ¡via ¡5 ¡heptad ¡repeats ¡based ¡on ¡GCN4 ¡leucine ¡ • zipper ¡ I/L ¡placed ¡variously ¡@ ¡ a ¡and ¡ d ¡posi&ons ¡to ¡promote ¡di-‑, ¡tri-‑ ¡& ¡tetramerisa&on ¡ • Thiol-‑linked ¡immobilisa&on ¡to ¡surface ¡achieved ¡via ¡C-‑terminal ¡Cys ¡ • Ques&on: ¡do ¡the ¡ligands ¡oligomerise ¡as ¡designed? ¡ •
Construc&on ¡of ¡hydrodynamic ¡bead ¡models ¡ From ¡vector ¡(including ¡His-‑tag) ¡– ¡too ¡short ¡for ¡e.g. ¡SWISSMODEL ¡ • FN ¡III ¡9-‑10 ¡domain ¡pair ¡homology ¡model ¡(SWISSMODEL) ¡ • Coiled-‑coil ¡(42 ¡a.a.) ¡– ¡SWISSMODELs ¡generated ¡for ¡underlined ¡segment ¡ • Synthesised ¡“missing ¡beads” ¡ • ! ¡ Kreiner ¡ et ¡al. , ¡(2009) ¡Biophysical ¡Chemistry ¡142 ¡34-‑39 ¡
Oligomer ¡models ¡generated ¡ linear ¡monomer ¡ bent ¡monomer ¡ s ¡= ¡1.7 ¡S ¡ s ¡= ¡1.8 ¡S ¡ linear ¡dimer ¡ bent ¡dimer ¡ s ¡= ¡2.7 ¡S ¡ s ¡= ¡2.5 ¡S ¡ ¡ Kreiner ¡ et ¡al. , ¡(2009) ¡Biophysical ¡Chemistry ¡142 ¡34-‑39 ¡
Oligomer ¡models ¡generated ¡ linear ¡trimer ¡ bent ¡trimer ¡ s ¡= ¡3.9 ¡S ¡ s ¡= ¡3.1 ¡S ¡ ¡ Kreiner ¡ et ¡al. , ¡(2009) ¡Biophysical ¡Chemistry ¡142 ¡34-‑39 ¡
Oligomer ¡models ¡generated ¡ linear ¡tetramer ¡ bent ¡tetramer ¡ s ¡= ¡4.7 ¡S ¡ s ¡= ¡3.7 ¡S ¡ linear ¡hexamer ¡ s ¡= ¡5.0 ¡S ¡ ¡ Kreiner ¡ et ¡al. , ¡(2009) ¡Biophysical ¡Chemistry ¡142 ¡34-‑39 ¡
AUC ¡SV ¡no ¡DTT: ¡c(s) ¡analysis ¡reveals ¡complex ¡composi&on ¡ 1 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡2 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡3 ¡ ¡ ¡ ¡4 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡6 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ “dimer” ¡ “trimer” ¡ “tetramer” ¡ ¡ Kreiner ¡ et ¡al. , ¡(2009) ¡Biophysical ¡Chemistry ¡142 ¡34-‑39 ¡
AUC ¡SV ¡+ ¡DTT: ¡c(s) ¡analysis ¡reveals ¡simplified ¡composi&on ¡ 1 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡2 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡3 ¡ ¡ ¡ ¡4 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡6 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ “dimer” ¡ “trimer” ¡ “tetramer” ¡ ¡ Kreiner ¡ et ¡al. , ¡(2009) ¡Biophysical ¡Chemistry ¡142 ¡34-‑39 ¡
Overall ¡conclusions ¡ All ¡ligands ¡are ¡rela&vely ¡hydrophobic ¡ • Monomer ¡could ¡be ¡straight ¡or ¡bent ¡ • Dimer, ¡trimer ¡and ¡tetramer ¡have ¡straight ¡conforma&ons ¡ • Trimer ¡dimerises ¡via ¡C-‑terminal ¡Cys ¡ • ¡ Kreiner ¡ et ¡al. , ¡(2009) ¡Biophysical ¡Chemistry ¡142 ¡34-‑39 ¡
Structure ¡of ¡this ¡session ¡ Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡ • Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡ • AUC ¡instrumenta&on ¡ • Modes ¡of ¡opera&on ¡ • Some ¡theory ¡ • SE ¡ versus ¡SV ¡ • Data ¡analysis ¡ • Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡ • Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡ • Some ¡theory ¡ • SoOware ¡ • HYDRO++ ¡ • • Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α 5 β 1 ¡ligands ¡ HYDROPRO ¡ • SOMO ¡ • • Example: ¡Tpx ¡ ¡
HYDROPRO ¡computes ¡hydrodynamic ¡(& ¡other) ¡parameters ¡ from ¡PDB ¡files ¡ atomic element minibead s, etc ¡ García ¡de ¡la ¡Torre ¡ et ¡al . ¡2000 ¡Biophys ¡J. ¡78 ¡719-‑730 ¡
HYDROPRO ¡input ¡is ¡PDB ¡plus ¡“control” ¡file ¡
HYDROPRO ¡runs ¡in ¡DOS ¡window ¡ ¡ hpp://leonardo.inf.um.es/macromol/programs/hydropro/hydropro.htm ¡
Performs ¡hydrodynamic ¡calcula&ons ¡for ¡shell ¡model ¡ ¡ hpp://leonardo.inf.um.es/macromol/programs/hydropro/hydropro.htm ¡
Output ¡is ¡hydrodynamic ¡+ ¡other ¡parameters ¡ ¡ ¡ hpp://leonardo.inf.um.es/macromol/programs/hydropro/hydropro.htm ¡
Primary ¡bead ¡model ¡can ¡be ¡viewed ¡in ¡vrml ¡viewer ¡
s ¡is ¡a ¡constraint ¡for ¡ ab ¡ini:o ¡ SAS ¡models ¡ HYDROPRO+DAMs: ¡IMPORTANT ¡ • Select ¡atomic ¡element ¡radius ¡> ¡DAM ¡packing ¡radius ¡to ¡ensure ¡hydrodynamic ¡model ¡properly ¡ • filled ¡ Can ¡calculate ¡effec&ve ¡hydra&on ¡of ¡hydrodynamic ¡model ¡ • Should ¡be ¡≥ ¡hydra&on ¡of ¡DAM. ¡DAM ¡volume ¡= ¡that ¡from ¡which ¡water ¡molecules ¡are ¡excluded ¡ • which ¡therefore ¡includes ¡some ¡effec&ve ¡hydra&on ¡but ¡not ¡as ¡much ¡as ¡hydrodynamic ¡ hydra&on ¡ DRMs: ¡IMPORTANT ¡ • Need ¡to ¡delete ¡dummy ¡waters ¡ • HYDRO ¡gives ¡anhydrous ¡parameters ¡ • • Hydrate ¡accordingly ¡-‑ ¡e.g. ¡via ¡uniform ¡expansion ¡ HYDROPRO ¡gives ¡an ¡effec&ve ¡hydra&on ¡ •
Structure ¡of ¡this ¡session ¡ Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡ • Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡ • AUC ¡instrumenta&on ¡ • Modes ¡of ¡opera&on ¡ • Some ¡theory ¡ • SE ¡ versus ¡SV ¡ • Data ¡analysis ¡ • Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡ • Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡ • Some ¡theory ¡ • SoOware ¡ • HYDRO++ ¡ • • Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α 5 β 1 ¡ligands ¡ HYDROPRO ¡ • SOMO ¡ • • Example: ¡Tpx ¡ ¡
SOMO ¡-‑ ¡construc&on ¡of ¡“intelligently” ¡hydrated ¡bead ¡ models ¡from ¡atomic ¡coordinates ¡ Water ¡of ¡hydra&on ¡included ¡ • AtoB ¡ in ¡each ¡bead ¡ Bead ¡overlaps ¡removed ¡ • B C heirarchically ¡ Reducing ¡radii ¡+ ¡transla&ng ¡bead ¡ • Popped beads centres ¡outwards ¡ A Beads ¡overlapping ¡by ¡> ¡preset ¡ • threshold ¡are ¡fused ¡ ¡ (“popped”) ¡ ¡ Trans ¡ Buried ¡beads ¡excluded ¡from ¡ ¡ • C B ¡ hydrodynamic ¡calcula&ons ¡ exposed ¡acidic ¡ ¡ Reduces ¡cpu ¡&me ¡ exposed ¡basic ¡ • exposed ¡polar ¡ exposed ¡nonpolar/hydrophobic ¡ mainchain ¡ D E buried ¡ ¡ ¡ Rai, ¡Nöllmann, ¡Spotorno, ¡Tassara, ¡Byron ¡& ¡Rocco, ¡Structure ¡(2005) ¡13, ¡723-‑734 ¡
SOMO ¡or ¡AtoB? ¡ AtoB ¡valuable ¡in ¡reducing ¡the ¡number ¡of ¡fric&onal ¡elements ¡in ¡HBM ¡ • 2 Å 3 Å 5 Å 8 Å SOMO ¡uses ¡a ¡fixed ¡resolu&on ¡and ¡preserves ¡“chemistry” ¡ ¡ • (T2)
SOMO ¡– ¡a ¡module ¡within ¡UltraScan ¡II ¡ ¡ hpp://www.ultrascan.uthscsa.edu ¡
1: ¡Load ¡PDB ¡file ¡ ¡ hpp://www.ultrascan.uthscsa.edu ¡
2: ¡File ¡read, ¡checked ¡for ¡compa&bility, ¡displayed ¡with ¡ RasMol ¡ ¡ hpp://www.ultrascan.uthscsa.edu ¡
3: ¡Compute ¡and ¡display ¡bead ¡model ¡ ¡ hpp://www.ultrascan.uthscsa.edu ¡
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