Tom C. Badge,, M.D., Ph.D. Peter Johansson, Ph.D. - PowerPoint PPT Presentation

Tom ¡C. ¡Badge,, ¡M.D., ¡Ph.D. ¡ Peter ¡Johansson, ¡Ph.D. ¡ Pediatric ¡Hematology-­‑Oncology ¡Fellow ¡ Pediatric ¡Oncology ¡Branch ¡ Johns ¡Hopkins ¡Hospital ¡and ¡ ¡ NaConal ¡Cancer ¡InsCtute, ¡NIH ¡ the ¡NaConal ¡Cancer ¡InsCtute ¡

Neuroblastoma ¡ • Most ¡common ¡extracranial ¡solid ¡tumor ¡of ¡ childhood. ¡ • ~ ¡8 ¡% ¡of ¡all ¡childhood ¡cancers ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ • ~ ¡15% ¡of ¡deaths ¡from ¡childhood ¡cancers ¡ ¡ • ~ ¡600 ¡new ¡cases ¡in ¡the ¡U.S. ¡annually ¡ • Arises ¡in ¡SympatheCc ¡Nervous ¡System ¡

Germ ¡ Primary ¡ Met ¡ line ¡ Tumor ¡ • To ¡portray ¡progression ¡of ¡a ¡neuroblastoma ¡genome ¡ ¡ ¡ ¡ ¡Single ¡Nucleo6de ¡Variants ¡ • ¡ ¡ ¡ ¡Chromosomal ¡Aberra6ons ¡ •

Diagnosis ¡ Bone ¡Marrow ¡ ~4 ¡Months ¡ Surgery ¡ ¡ 3 ¡years ¡ Death ¡ ¡

Outline ¡ • Second ¡GeneraCon ¡Sequencer ¡ • IdenCfy ¡SomaCc ¡MutaCons ¡ ¡ ¡ ¡ Two ¡SomaCc ¡MutaCons ¡in ¡Expressed ¡Genes ¡ • Chromosomal ¡Changes ¡ ¡ ¡ ¡ Stable ¡Pa,ern ¡of ¡Allelic ¡Imbalance ¡

• Targeted ¡37.8Mb ¡

SOLiD ¡4-­‑color ¡liga6on ¡chemistry ¡system ¡ S equencing ¡by ¡ O ligonucleoCde ¡ Li gaCon ¡and ¡ D etecCon ¡

SOLiD ¡4-­‑color ¡liga6on ¡chemistry ¡system ¡ S equencing ¡by ¡ O ligonucleoCde ¡ Li gaCon ¡and ¡ D etecCon ¡

SOLiD ¡4-­‑color ¡liga6on ¡chemistry ¡system ¡ S equencing ¡by ¡ O ligonucleoCde ¡ Li gaCon ¡and ¡ D etecCon ¡ IMAGING ¡

SOLiD ¡4-­‑color ¡liga6on ¡chemistry ¡system ¡ S equencing ¡by ¡ O ligonucleoCde ¡ Li gaCon ¡and ¡ D etecCon ¡

SOLiD ¡4-­‑color ¡liga6on ¡chemistry ¡system ¡ S equencing ¡by ¡ O ligonucleoCde ¡ Li gaCon ¡and ¡ D etecCon ¡

SOLiD ¡4-­‑color ¡liga6on ¡chemistry ¡system ¡ S equencing ¡by ¡ O ligonucleoCde ¡ Li gaCon ¡and ¡ D etecCon ¡

2 ¡Base ¡Encoding ¡Improves ¡Accuracy ¡

Advantages ¡of ¡2 ¡base ¡encoding ¡ True ¡polymorphisms ¡produce ¡2 ¡color ¡changes ¡while ¡system ¡errors ¡produce ¡a ¡single ¡color ¡change ¡

Advantages ¡of ¡2 ¡base ¡encoding ¡ C ¡ C ¡ True ¡polymorphisms ¡produce ¡2 ¡color ¡changes ¡while ¡system ¡errors ¡produce ¡a ¡single ¡color ¡change ¡

Diagnosis ¡ Bone ¡Marrow ¡ ~4 ¡Months ¡ Surgery ¡ ¡ 3 ¡years ¡ Death ¡ ¡

Reference:GATCGTAGCCTATGGATCAATGCGAAATCGTAGCCTATTGGATCAATGCCGATCGTAGCCAGCCTATTG � ATCGTAGCCTATGGATCAATGCGAAATCGTAGCCTATTGGATCAGTGCCG � TCGTAGCCGATGGATCAATGCGAAATCGTAGCCGATTGGATCAATGCCGA � CGTAGCCTATGGATCAATGCGAAATCGTAGCCTATTGGATCAATGCCGAT � GTAGCCTATGGATCACTGCGAAATCGTAGCCGATTGGATCAATGCCGATC � GTAGCCTATGGATCACTGCGAAATCGTAGCCGATTGGATCAATGCCGATC � AGCCTATGGATCAATGCGAAATCGTAGCCGATTGGATCAATGCCGATCGT � CCTATGGATCAATGCGAAATCGTAGCCGATTGGATGAATGCCGATCGTAG � CTATGGATCAATGCGAAATCGTAGCCTATTGGATCAATGCCGATCGTAGC � TATGGATCAATGCCAAATCGTAGCCGATTGGATCAATGCCGATCGTAGCC �

Sequencing ¡Reads ¡ Map ¡reads ¡to ¡ reference ¡genome ¡ Mapped ¡Reads ¡ Filter ¡low ¡quality ¡and ¡ non-­‑uniquely ¡ mapped ¡reads ¡ High ¡Quality ¡Mapped ¡Reads ¡

Sample Primary Tumor Met1 Met2 Liver Skin Number of Mapped Reads 279M 216M 217M 259M 181M High Quality Reads 231M 186M 180M 223M 153M On Target Reads 165M 146M 143M 175M 134M Coverage 187X 182X 184X 193X 205X

Second ¡Genera6on ¡Sequencing ¡ DNA ¡ RNA ¡ Muta6ons ¡ Muta6ons ¡ Inser6ons/Dele6ons ¡ Gene ¡Expression ¡ Copy ¡Number ¡ Splice ¡Variants ¡ Allelic ¡Imbalance ¡ Fusion ¡Genes ¡ Transloca6ons ¡ Novel ¡Transcripts ¡ Inversions ¡

Reference:GATCGTAGCCTATGGATCAATGCGAAATCGTAGCCTATTGGATCAATGCCGATCGTAGCCAGCCTATTG � ATCGTAGCCTATGGATCAATGCGAAATCGTAGCCTATTGGATCAGTGCCG � TCGTAGCCGATGGATCAATGCGAAATCGTAGCCGATTGGATCAATGCCGA � CGTAGCCTATGGATCAATGCGAAATCGTAGCCTATTGGATCAATGCCGAT � GTAGCCTATGGATCACTGCGAAATCGTAGCCGATTGGATCAATGCCGATC � GTAGCCTATGGATCACTGCGAAATCGTAGCCGATTGGATCAATGCCGATC � AGCCTATGGATCAATGCGAAATCGTAGCCGATTGGATCAATGCCGATCGT � CCTATGGATCAATGCGAAATCGTAGCCGATTGGATGAATGCCGATCGTAG � CTATGGATCAATGCGAAATCGTAGCCTATTGGATCAATGCCGATCGTAGC � TATGGATCAATGCCAAATCGTAGCCGATTGGATCAATGCCGATCGTAGCC �

Reference ¡

Reference ¡ 5 ¡ G ¡ invalid ¡ 1 ¡ 4 ¡ C ¡

Bayesian ¡Algorithm: ¡ P(Data|Genotype) ¡ ¡P(Genotype) ¡ P(Genotype|Data) ¡= ¡ P(Data) ¡

Bayesian ¡Algorithm: ¡ P(Data|Genotype) ¡ ¡P(Genotype) ¡ P(Genotype|Data) ¡= ¡ P(Data) ¡ Genotypes: ¡GG, ¡GC, ¡GT, ¡GA, ¡CC, ¡CT, ¡CA, ¡TT, ¡TA, ¡AA ¡ 0.999 ¡if ¡same ¡as ¡reference ¡(e.g. ¡GG) ¡ ¡ Prior: ¡P(Genotype) ¡= ¡ ¡ (1-­‑0.999)/9 ¡otherwise ¡

Bayesian ¡Algorithm: ¡ P(Data|Genotype) ¡ ¡P(Genotype) ¡ P(Genotype|Data) ¡= ¡ P(Data) ¡ P(Data|Genotype) ¡= ¡P(Read 1 |Genotype) ¡P(Read 2 |Genotype)… ¡

P(Read 1 |Genotype) ¡ Genotype ¡ GG ¡ Expected ¡Data ¡ (1-­‑p error ) ¡p error /3 ¡ Probability: ¡ (1-­‑p error ) 2 (P error /3) 2 ¡ ¡

P(Read 1 |Genotype) ¡ Genotype ¡ CC ¡ Expected ¡Data ¡ (1-­‑p error ) ¡p error /3 ¡ Probability: ¡ (P error /3) 2 ¡ (1-­‑P error ) 2 ¡

P(Read 1 |Genotype) ¡ Genotype ¡ GC ¡ Expected ¡Data ¡ (1-­‑p error ) ¡p error /3 ¡ Probability: ¡ 0.5(P error /3) 2 +0.5(1-­‑P error ) 2 ¡ 0.5(1-­‑P error ) 2 +0.5(P error /3) 2 ¡

Reference ¡ 5 ¡ G ¡ invalid ¡ 1 ¡ 4 ¡ C ¡

P(GG|Data) ¡= ¡P(GG) ¡P( ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡|GG) 5 P( ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡|GG) 1 P( ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡|GG) 4 ¡ P(GC|Data) ¡= ¡P(GC) ¡P( ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡|GC) 5 P( ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡|GC) 1 P( ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡|GC) 4 ¡ P(GG|Data) ¡= ¡P(CC) ¡P( ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡|CC) 5 P( ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡|CC) 1 P( ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡|CC) 4 ¡ 5 ¡ G ¡ invalid ¡ 1 ¡ 4 ¡ C ¡

SomaCc ¡MutaCon ¡DetecCon ¡ Tumor ¡ Germline ¡ diBayes ¡algorithm ¡ diBayes ¡algorithm ¡ Coverage ¡≥ ¡20X ¡ Coverage ¡≥ ¡20 ¡X ¡ VAF ¡≥ ¡20% ¡ VAF ¡≤ ¡5% ¡ Germline ¡ ¡ Tumor ¡Variant ¡ Same ¡as ¡Reference ¡ Soma6c ¡Variant ¡

EsCmaCon ¡of ¡False ¡Call ¡Rate ¡ Germline ¡DNA ¡ Germline ¡Lib ¡A ¡ Germline ¡Lib ¡B ¡ diBayes ¡algorithm ¡ diBayes ¡algorithm ¡ Coverage ¡≥ ¡20X ¡ Coverage ¡≥ ¡20 ¡X ¡ VAF ¡≥ ¡20% ¡ VAF ¡≤ ¡5% ¡ Lib ¡A ¡Variant ¡ Lib ¡B ¡Reference ¡ ~ ¡21,600 ¡ False ¡Soma6c ¡Call ¡ ~ ¡200 ¡(1%) ¡

SomaCc ¡MutaCon ¡DetecCon ¡ Tumor ¡ Germline ¡ diBayes ¡ diBayes ¡algorithm ¡ Coverage ¡≥ ¡20X ¡ Coverage ¡≥ ¡20 ¡X ¡ VAF ¡≥ ¡20% ¡ VAF ¡≤ ¡5% ¡ Germline ¡ Tumor ¡Variant ¡ ~ ¡30,000 ¡ Reference ¡ Soma6c ¡Variant ¡ ~ ¡600 ¡(2%) ¡ False ¡Calls: ¡~300 ¡(1% ¡of ¡30,000) ¡

SomaCc ¡MutaCons ¡ Primary ¡Tumor ¡ Met1 ¡Bone ¡Marrow ¡ Met2 ¡Liver ¡ ¡ Variants ¡ 29,593 ¡ 30,006 ¡ 29,131 ¡ SomaCc ¡Variants ¡ 627 ¡ 573 ¡ 634 ¡ Protein ¡Coding ¡Region ¡ 239 ¡ 243 ¡ 287 ¡ Non-­‑synonymous ¡Variant ¡ 163 ¡ 170 ¡ 195 ¡

Overlap ¡with ¡RNA ¡data ¡  ¡Reduce ¡false ¡posiCves ¡by ¡focusing ¡on ¡ ¡ ¡ ¡ ¡variants ¡detected ¡by ¡both ¡methods ¡  ¡IdenCfy ¡therapeuCc ¡target ¡– ¡expressed ¡by ¡nature ¡ ¡

Expressed ¡Nonsynonymous ¡Variants ¡ DNA ¡ RNA ¡ Soma6c ¡Variants ¡ At ¡least ¡3 ¡variant ¡ reads ¡ Nonsynonymous ¡ VAF ¡≥ ¡10% ¡ Expressed ¡Nonsynonymous ¡Variants ¡

Expressed ¡Nonsynonymous ¡Variants ¡ Primary ¡ Met1 ¡Bone ¡ Met2 ¡Liver ¡ ¡ Tumor ¡ Marrow ¡ Variants ¡ 29,593 ¡ 30,006 ¡ 29,131 ¡ SomaCc ¡Variants ¡ 627 ¡ 573 ¡ 634 ¡ Translated ¡Region ¡ 239 ¡ 243 ¡ 287 ¡ Non-­‑synonymous ¡ 163 ¡ 170 ¡ 195 ¡ Expressed ¡ 3 ¡ 3 ¡ 3 ¡

Expressed ¡Nonsynonymous ¡Variants ¡ Primary ¡ 1 ¡ Tumor ¡ 0 ¡ 0 ¡ 2 ¡ 1 ¡ 1 ¡ 0 ¡ Met1 ¡ Met2 ¡