B. hercules The Terminator of Colon Cancer Background & Motive - PowerPoint PPT Presentation

2012 HKUST iGEM Team B. hercules The Terminator of Colon Cancer

Background & Motive

Cancer Therapy & Synthetic Biology Our ¡project ¡  ¡Cancer ¡ Background & Motive

Colon Carcinomas – A Suitable Target Represent ¡>90% ¡of ¡colon ¡cancer ¡cases ¡ Accessible ¡to ¡agents ¡in ¡gut ¡ Background & Motive

Our Chassis • Gut ¡microbiome ¡ • Non-­‑pathogenic. ¡ Gene ¡integra7on ¡ • Lacks ¡virulence ¡ • Well-­‑understood. ¡ • Integrates ¡DNA ¡ • Provide ¡engineering ¡op7ons. ¡ Background & Motive

B. hercules ¡ Target: ¡ colon ¡carcinomas ¡ ¡ ¡ Tool: ¡ B. ¡sub'lis ¡ Background & Motive

Three Modules • Target ¡Binding ¡ • An>-­‑tumor ¡Molecule ¡Secre>on ¡ • Regula>on ¡& ¡Control ¡ Background & Motive

Target Binding Module 1

Tumor Recognition RPMrel ¡ Colon ¡Cancer ¡Cell ¡ Isola7on ¡of ¡a ¡colon ¡tumor ¡specific ¡binding ¡pep7de ¡using ¡phage ¡display ¡selec7on. ¡Kelly ¡& ¡Jones, ¡2003. ¡ ¡ ¡ Module 1

Tumor Recognition Colon ¡Cancer ¡Cell ¡ RPMrel ¡ Bacillus ¡ sub'lis ¡ Module 1

Cell Wall Display Helical ¡Linker ¡ LytC ¡ Module 1

Construct ¡ Pveg ¡ ¡ RBS ¡ lytC ¡ linker ¡ RPMrel ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ Double ¡ ¡ ¡ Terminator ¡ ¡ ¡ ¡ Module 1

Anti-tumor Molecule Secretion Module 2

Anti-tumor Drug Secrete ¡BMP2 ¡ BMP2 ¡ Bone ¡morphogene7c ¡protein ¡signaling ¡and ¡growth ¡suppression ¡in ¡colon ¡cancer. ¡Beck ¡at ¡al, ¡2006. ¡ Module 2

Secretion Out ¡ Membrane ¡ In ¡ Signal ¡ BMP2 ¡ pep>de ¡ Module 2

Secretion Cleavage ¡ Signal ¡ BMP2 ¡ pep>de ¡ Module 2

Secretion BMP2 ¡ Folding ¡ SPPase ¡ Module 2

Construct PxylA ¡ Signal ¡ ¡ ¡ Bmp2 ¡ RBS ¡ xylR ¡ ¡ pep>de ¡ ¡ Module 2

BMP2 Functional Assay Viability ¡of ¡HT-­‑29 ¡Cells ¡Following ¡Co-­‑Culture ¡with ¡ B. ¡sub'lis ¡ B. ¡sub7lis ¡transformed ¡with ¡empty ¡vector ¡ B. ¡sub'lis ¡ B. ¡sub'lis ¡ B. ¡sub7lis ¡transformed ¡to ¡express ¡BMP2 ¡ 100 ¡ 90 ¡ Percentage ¡of ¡Viable ¡Cells ¡ 80 ¡ 70 ¡ 60 ¡ 50 ¡ 40 ¡ 30 ¡ 20 ¡ 10 ¡ 0 ¡ 0.0001 ¡ 0.001 ¡ 0.01 ¡ 0.1 ¡ B. ¡sub'lis ¡ Concentra>on ¡(OD650) ¡ Module 2 Module 2

Regulation & Control Module 3

Regulation Systems Two ¡Regula>on ¡Systems ¡ 1. ¡Time ¡Control ¡ 2. ¡Dosage ¡Regula>on ¡ Module 3

Xylose-Inducible Promoter PxylA ¡ ¡ RBS ¡ xylR ¡ ¡ A ¡xylose-­‑inducible ¡ Bacillus ¡sub'lis ¡integra7on ¡vector ¡and ¡its ¡applica7on. ¡Kim ¡et ¡al, ¡1996. ¡ ¡ ¡ Module 3

Xylose-Inducible Promoter PxylA ¡ Signal ¡ ¡ Bmp2 ¡ ¡ xylR ¡ RBS ¡ pep>de ¡ ¡ ¡ XylR ¡ Inhibited ¡Transcrip>on ¡ Module 3

Xylose-Inducible Promoter PxylA ¡ Signal ¡ ¡ Bmp2 ¡ ¡ xylR ¡ RBS ¡ pep>de ¡ ¡ ¡ xylose ¡ XylR ¡ Transcrip>on ¡Proceeds ¡ Module 3

Growth Inhibition Device ¡ 2 R B S ¡ p m y d B c ¡ E ¡ ¡ l a n g i S ¡ e d > p e p EndoA ¡ EndoAI ¡ Toxin ¡ An>toxin ¡ The ¡ Bacillus ¡sub'lis ¡ydcDE ¡operon ¡encodes ¡an ¡endoribonuclease ¡of ¡the ¡MazFPemK ¡family ¡and ¡its ¡inhibitor. ¡Pelligrini ¡et ¡al, ¡2005 ¡ Module 3

Growth Inhibition Device EndoAI ¡ ¡ Bacillus ¡ ¡ (An>toxin) ¡ sub'lis ¡ ¡ A o d n E ¡ ) n i x o T ( G r o w t h ¡ I n h i b i > o n ¡ Module 3

Ptms Characterization Ptms ¡ J23101 ¡ ¡ ¡ Double ¡ Double ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ RBS ¡ GFP ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ RBS ¡ GFP ¡ ¡ ¡ terminator ¡ terminator ¡ GFP ¡Synthesis ¡Rate ¡(Slope) ¡ Promoter ¡Ac>vity ¡= ¡ OD ¡(Average ¡OD595) ¡ ¡ Promoter ¡Ac>vity ¡ ¡ Promoter ¡Ac>vity ¡ ¡ of ¡ Ptms ¡ of ¡Standard ¡Promoter ¡ Rela>ve ¡Promoter ¡Unit ¡(RPU) ¡of ¡ Ptms ¡ = to ¡reference ¡standard ¡promoter ¡ Module 3

Ptms has Low Activity Ptms ¡& ¡J23101 ¡GFP ¡Intensity ¡ RPU: ¡0.046 ¡ Ptms ¡ Ptms ¡ J23101 ¡ 450 ¡ GFP ¡Intensity ¡(Arbitrary ¡Units) ¡ 400 ¡ 350 ¡ 300 ¡ y ¡= ¡35.45x ¡+ ¡225.7 ¡ 250 ¡ 200 ¡ 150 ¡ 100 ¡ y ¡= ¡3.4x ¡+ ¡3.8 ¡ 50 ¡ 0 ¡ 0 ¡ 15 ¡ 30 ¡ 45 ¡ 60 ¡ Time ¡(minutes) ¡ Module 3

P xylA is Inducible P xylA ¡Promoter ¡Ac>vity ¡Induced ¡With ¡0-­‑10% ¡Xylose ¡ 350 ¡ GFP ¡Synthesis ¡Rate/Average ¡OD595 ¡ 300 ¡ 250 ¡ 200 ¡ 150 ¡ 100 ¡ 50 ¡ 0 ¡ 0% ¡ 1% ¡ 2% ¡ 3% ¡ 4% ¡ 5% ¡ 10% ¡ Xylose ¡Concentra>on ¡ Module 3

Growth Inhibition Characterization Control ¡Group ¡ Experiment ¡Group ¡ Xylose ¡concentra'on ¡from ¡le6 ¡to ¡right ¡(both ¡groups): ¡0.00%, ¡0.05%, ¡0.10%, ¡0.15%, ¡0.20%, ¡0.25% ¡ Module 3

Assembly

Three Modules • Target ¡Binding ¡ • An>-­‑tumor ¡Molecule ¡Secre>on ¡ • Regula>on ¡& ¡Control ¡ Assembly

Modules Assembled EndoAI ¡ RPMrel ¡ EndoA ¡ LytC ¡ PxylA ¡ BMP2 ¡ ¡ ¡ P t m s ¡ xylR ¡ Secre>on ¡ Toxin ¡ ¡ ¡ RPMrel ¡ ¡ ¡ An>-­‑ Expression ¡ ¡ ¡ amyE ¡5’ ¡ toxin ¡ amyE ¡3’ ¡ Bacterial ¡ Chromosome ¡ Assembly

Achievements & Future Work

Our Work • P xylA , ¡ Ptms ¡func>on ¡as ¡expected. ¡ • Cell ¡growth ¡inhibi>on ¡device ¡func>ons. ¡ ¡ • RPMrel ¡produc>on ¡– ¡work ¡in ¡progress. ¡ • BMP2 ¡produc>on ¡– ¡work ¡in ¡progress. ¡ Achievements & Future Work

• ANIMATION? ¡

Human Practice

Presentation Presenta>on ¡at ¡Hong ¡ Kong ¡Cancer ¡Fund Human Practice – Presentation

Objective & Role Human Practice – Presentation

Presentation Human Practice – Presentation

Positive Feedback Some ¡of ¡the ¡seeds ¡have ¡[been] ¡planted ¡which ¡will ¡allow ¡us ¡to ¡keep ¡a ¡ close ¡eye ¡to ¡its ¡(synthe'c ¡biology’s) ¡development. ¡ -­‑-­‑-­‑ ¡Ms. ¡HSUEH, ¡the ¡Head ¡of ¡Wellness ¡and ¡Holis7c ¡Health ¡Care Synthe'c ¡biology ¡can ¡be ¡used ¡to ¡improve ¡cancer ¡treatment. ¡ ¡-­‑-­‑-­‑ ¡Respondent ¡A Synthe'c ¡biology ¡will ¡give ¡cancer ¡pa'ents ¡hope. ¡ -­‑-­‑-­‑ ¡Respondent ¡B This ¡presenta'on ¡is ¡clear ¡and ¡professional. ¡ -­‑-­‑-­‑ ¡Respondent ¡C Human Practice – Presentation

Interviews Human Practice – Interviews

Interviews POLITICIAN ¡ JOURNALIST UNIVERSITY ¡STUDENT HIGH ¡SCHOOL ¡STUDENT Human Practice – Interviews

Interviews …I ¡will ¡listen ¡to ¡their ¡complaints ¡sincerely ¡as ¡a ¡ responsible ¡listener… ¡ ¡ …I ¡will ¡tell ¡them ¡how ¡to ¡raise ¡this ¡issue ¡to ¡higher ¡ authori'es… ¡ ¡ …But ¡the ¡final ¡decision ¡should ¡be ¡made ¡only ¡by ¡the ¡ majority… ¡ ¡ ¡ ¡-­‑-­‑-­‑ ¡ The ¡poli7cian, ¡Mr. ¡SHUM ¡ Human Practice – Interviews

Interviews • Gather ¡informa7on ¡about ¡ the ¡interviewees. ¡ ¡ • Generate ¡an ¡interview ¡ outline ¡and ¡ques7ons ¡ specifically ¡targeted ¡at ¡the ¡ interviewee. ¡ • Guide ¡your ¡interviewers ¡ and ¡train ¡them ¡to ¡be ¡good ¡ interviewers. ¡ Human Practice – Interviews

Human ¡Prac>ce ¡ Presenta>on ¡ Interviews ¡ Human Practice

Recap

Recap Toxin-­‑ Cell ¡growth ¡ an7toxin ¡ inhibi7on ¡ casseee ¡ Colon ¡tumor ¡ Chemokine ¡ growth ¡ expression ¡ suppression ¡ Tumor ¡ Pep7de ¡ targe7ng ¡ display ¡ Integrated ¡ B. ¡sub'lis ¡ Genes ¡

Acknowledgements • Office ¡of ¡the ¡Dean ¡of ¡Science ¡ • Office ¡of ¡the ¡Provost ¡ – The ¡Hong ¡Kong ¡University ¡of ¡Science ¡& ¡Technology ¡

2012 HKUST iGEM Team B. hercules The Terminator of Colon Cancer